中华绒螯蟹性腺抑制激素基因克隆与序列分析

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中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国名优淡水养殖业的主要品种,也是我国一种重要的经济蟹类,广泛存在于我国南北各地淡水水域中。而普遍发生1龄蟹性早熟的现象严重影响其产量,给生产带来巨大损失。本文用基因工程方法来研究在中华绒螯蟹性腺发育过程起重要作用的性腺抑制激素。主要分为两部分:(1)获得中华绒螯蟹性腺抑制激素编码框内部分序列片段。(2)通过3’RACE得到基因序列片段的3’端。本实验在解剖中华绒螯蟹视上神经节的基础上,使用TRIzol试剂提取中华绒螯蟹视上神经节总RNA, RT-PCR扩增编码性腺抑制激素(GIH)基因片段。用改进的冻融离心法纯化片段,片段与pMD19-T载体连接,转化大肠杆菌JM109,经抗性筛选、PCR鉴定、质粒电泳鉴定等方法筛选阳性克隆并测序,所测得100bp序列与三种已知性腺抑制激素前体序列相似性较高,其中有两段序列共40bp与三种性腺抑制激素一致,且相似区域都在三种性腺抑制激素的编码框架之内。用所测序列中与三种龙虾性腺抑制激素前体相似性最高的两个区域设计特异引物,再次提取中华绒螯蟹视上神经节总RNA,RT-PCR扩增到5个片段。分别克隆后,其中四个序列在5’端与上述序列有很高的相似性,仅有2个碱基的差别。其中一个序列含有polyA尾,通过序列分析发现测序结果与三种龙虾性腺抑制激素前体有较高的相似性,推测所得序列为中华绒螯蟹性腺抑制激素基因片段。
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