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研究目的:CD19+B-ALL患者经BiTE治疗未达缓解,且流式细胞检测发现该例患者CD19抗原表达转阴。患者在疾病进展退出BiTE治疗组之后,采用我们自主研发的CD22 CAR-T及CD19 CAR-T序贯治疗后获得完全缓解。本研究旨在了解该患者BiTE治疗前后CD19异构体表达情况及抗原谱系的变化,明确BiTE治疗失败是否与CD19抗原表位缺失相关,进一步对抗原转阴的免疫逃逸机制及CD19靶抗原缺失时采取的治疗方案进行探讨。研究方法:流式细胞术检测患者治疗前后白血病相关免疫表型及微小残留白血病细胞,明确异常细胞比例及CD19抗原表达水平。提取患者治疗前后骨髓单个核细胞总RNA,逆转录为cDNA,进行半定量RT-PCR方法,验证患者治疗前后CD19异构体mRNA表达量的情况,sanger测序对三个条带纯化产物的序列进行进一步验证。应用RT-PCR方法,检测患者治疗前后骨髓标本CD19各个外显子区的表达水平,设计针对不同外显子区的引物对CD19的各个外显子区进行扩增,采用跨1号及3号外显子的特异性引物扩增2号外显子缺失型CD19 mRNA。采用转录组测序分析BiTE治疗前后患者骨髓细胞谱系特异性分子的表达情况、差异表达的可变剪接基因及CD19各个转录本的表达情况。研究结果:BiTE治疗前流式细胞检测发现:异常细胞占有核细胞的60.51%,表达CD19;第一周期BiTE输注治疗后第1 1天,患者出现白细胞及外周血幼稚细胞比例增高,复查骨髓幼稚细胞比例增高,流式细胞检测显示异常细胞占有核细胞的80.43%,表达cCD79a、CD10,部分表达CD34,不表达CD19,弱表达CD22、CD20、CD38及CD45,为异常B淋巴母细胞,患者经BiTE治疗未达缓解,CD19抗原表达转阴。PCR扩增患者治疗前后CD19基因的1-5号外显子区,均能扩增出2号外显子缺失型及部分缺失型异构体,扩增条带长度分别为800bp,533bp,670bp,分别对应CD19的胞外区全长、2号外显子部分缺失及缺失型三种异构体类型;sanger测序对三个条带纯化产物的序列进行了进一步验证,显示三条带分别对应CD19 1-5号外显子全长,1-3号外显子跳跃及2号外显子存在130bp的缺失。该患者在BiTE治疗前即存在2号外显子缺失及部分缺失型CD19异构体。PCR扩增该患者治疗前后4-8号外显子,仅扩增出单一的490bp条带,未出现缺失331bp的5-6号外显子缺失型异构体,sanger测序验证纯化产物,结果显示该490bp的条带为4-8号外显子全长,该患者治疗前并不存在5-6号外显子缺失型异构体。CD19 mRNA在针对不同外显子的不同引物扩增下出现2～3倍左右的下降。转录组测序也显示,编码蛋白的两种CD19转录本水平在治疗后有约1～2倍的下降。转录组测序可变剪接部分的差异基因(FDR<0.05)中也并未筛选到CD19,2号外显子缺失型CD19异构体的表达在治疗后并未出现累积。采用转录组测序分析BiTE治疗前后患者骨髓细胞谱系特异性分子的表达情况,BiTE治疗后CD19转录组水平表达降低,未见髓系特异性分子CD33、CD123、CD117 表达的升高。研究结论:患者初诊时即存在2号外显子缺失型CD19异构体的表达,BiTE治疗后患者未缓解,流式细胞术检测发现CD19抗原表达转阴,但2号外显子缺失型CD19异构体的表达量并无增加,且流式检测细胞表型及转录组测序均未见谱系转化的发生。因此,外显子可变剪接引起的缺失型CD19异构体的表达及谱系转化并非该患者CD19抗原表位缺失的机制。该例患者在疾病进展退出BiTE治疗组之后,采用我们自主研发的CD22及CD19 CAR-T序贯治疗后完全缓解。在CD19靶抗原缺失时更换其他治疗靶点或进行双靶点治疗是一种有效的治疗方案。研究目的:IDH1突变与NPM1突变常见在AML患者中共同出现,但这些基因改变是否与特定的免疫表型及疾病预后相关尚未明确。本研究旨在探讨NPM1突变联合IDH1突变对对小鼠原代c-kit细胞生物学功能的影响,并确定NPM1联合IDH1突变的载体在小鼠模型中诱导白血病发生的能力,进一步阐明NPM1突变与IDH1突变的联合作用在急性白血病发生中的作用,对疾病发生发展的影响进行探讨。研究方法:构建单独突变的 pMSCV-NPMcA-myc-GFP、pMSCV-IDH1R132H-flag-GFP 和联合突变逆转录病毒载体pMSCV-IDH1R132H-T2A-NPMcA-GFP,包装病毒后感染3T3细胞,通过Western blot鉴定目的基因表达情况。用免疫磁珠富集C57小鼠骨髓c-kit+细胞,分别感染NPM1和IDH1单独突变及联合突变载体和空载体病毒后进行体内外实验。将感染后的c-kit+细胞进行流式分选,获得GFP阳性细胞并在甲基纤维素中培养,检测其集落形成能力;采用流式细胞术检测一代集落细胞表面分化相关分子CD11b、Gr-1和TER-1 19的表达,以分析其分化能力;并通过检测G0期细胞的比例,以明确联合突变能否通过改变c-kit细胞的细胞周期从而影响细胞干性。经尾静脉移植1×105 GFP阳性细胞至经致死剂量照射的C57小鼠以构建白血病模型,定期监测小鼠状态及流式细胞术检测外周血GFP阳性细胞的比例。研究结果:成功构建了单独突变的pMSCV-NPMcA-myc-GFP、pMSCV-IDH1R132H-flag-GFP和联合突变逆转录病毒载体pMSCV-IDH1R132H-T2A-NPMcA-GFP,蛋白表达检测显示感染后的细胞中高表达相应目的蛋白。体外实验表明,转导联合突变基因的c-kit细胞与对照组相比,集落形成能力并未增加;同时联合突变基因的表达对一代集落细胞的分化并无明显影响;G0期检测发现,联合突变虽然在一定程度上可能会导致c-kit处于G0期细胞比例的上升,导致更多的c-kit细胞处于静止期,但该比例上升并不显著。体内实验结果显示,观察期内转导NPMcA-T2A-IDH1R132H逆转录病毒的实验组及NPMcA、IDH1R132H逆转录病毒和空载体病毒的对照组均未检测到GFP阳性细胞,且均未见白血病发生。研究结论:体外试验中,NPM1与IDH1联合突变对小鼠c-kit+的原代细胞集落形成能力及分化能力和细胞周期均并无明显影响,且在体内未能诱导小鼠白血病的发生。