东亚飞蝗内质网I型信号肽酶亚基(LmSPC1)的基因克隆与功能研究

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生物体内,分泌蛋白成功转运到达目的地,以便行使其特定生物功能,依赖于信号肽酶的加工。I型信号肽酶是其中最为重要的一种,原核I型信号肽酶及真核ER I型信号肽酶对于所有单细胞生物的存活是必须的。但ER I型信号肽酶在多细胞生物中的功能尚不明确。  东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis, Meyen)作为一种典型的渐变态昆虫,是一种优良的模式系统,可用于发育生物学、神经学、生理学和进化学研究。此外,作为最具破坏性的农业害虫之一,东亚飞蝗在世界范围内,对粮食生产造成了巨大损失。当前,东亚飞蝗的防治主要以传统的,有机磷为代表的化学防治方法为主。与其它化学农药类似,该防治方法无疑地增加了害虫自身的抗药性(Resistance),农药残留(Residue)及再猖獗(Resurgence)等一系列生态、环境及安全等问题。因此,有必要开展一种以低毒、高效、安全为目的新型害虫防治策略,为解决此类问题提供依据。  RNAi技术无疑为这种新型防治策略提供了可能。然而,此类防治策略的有效应用,依赖于寻找到一类对害虫自身存活或生长发育至关重要的靶基因。因此,有必要以东亚飞蝗为材料,寻找对其存活或生长发育所必须的基因,以便为此类新型防治策略提供潜在的杀虫靶标。  本研究主要结果有:  ① LmSPC1基因克隆与序列分析  克隆得到一个东亚飞蝗 I型信号肽酶亚基(LmSPC1)基因的cDNA全长,Genebank登陆号为KC576515。该基因cDNA全长1289 bp,开放阅读框537 bp,编码178个氨基酸残基,预测分子量为21 kDa。LmSPC1包含所有I型信号肽酶所共有的五个保守结构域box A-E。  ② LmSPC1不同组织表达特征分析  以半定量的方式对 LmSPC1在东亚飞蝗五龄虫中不同组织的表达特征进行分析,发现该基因在所有组织中均表达,但以头、中肠、脂肪体、卵巢、精巢、后腿中表达量较高。  ③ LmSPC1对东亚飞蝗的存活是必须的  以dsRNA注射的方式,分别对东亚飞蝗五龄及成虫LmSPC1基因进行干扰,结果发现无论五龄还是成虫其半致死时间相比对照均显著提前。表明 LmSPC1对东亚飞蝗的存活是必须的。  ④ LmSPC1通过影响蜕皮液中蛋白酶的分泌影响东亚飞蝗蜕皮  通过五龄虫生测,发现LmSPC1 dsRNA注射的幼虫存在明显的蜕皮障碍,并且五龄虫的死亡时间主要集中在蜕皮时期。且进一步对蜕皮液中蜕皮液蛋白酶活性进行测定,发现RNAi处理组蜕皮液蛋白酶(MFP)活性相比对照显著降低。因此,证实LmSPC1通过影响蜕皮液中一些分泌酶的分泌来影响东亚飞蝗蜕皮。  ⑤ LmSPC1通过影响消化酶的分泌影响东亚飞蝗取食与消化  通过对LmSPC1 dsRNA注射五龄虫体重及粪便干重连续测量,发现RNAi处理组,在蜕皮前及蜕皮后数天体重及粪便干重显著下降,同时排出的粪便量明显减少。此外,干扰组幼虫胃盲囊明显萎缩。进一步对中肠中,淀粉酶及纤维素酶活性进行测定,发现它们的比活相比对照显著均下降,但平均每条中肠中的总蛋白含量并无显著差异。因此,证实 LmSPC1很可能通过影响消化道中消化酶或其它相关酶的分泌来影响东亚飞蝗的取食与消化。  ⑥ LmSPC1通过影响雌性卵巢发育影响东亚飞蝗雌性繁殖及胚胎发育  通过母性RNAi技术发现,RNAi处理组雌虫的产卵量及孵化率相比对照均显著下降,并发现干扰组卵巢发育明显受阻。此外,母性RNAi后,少数胚胎的后腿存在明显的畸形现象,并且这些未发育的胚胎大部分停滞在第一个胚胎半形成阶段。因此,LmSPC1很可能通过影响雌性卵巢发育来影响雌性产卵及胚胎发生。
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