研究背景:多发性硬化症(MS)是一种最常见的自身免疫炎症中枢神经系统脱髓鞘疾病,主要是由CD4~+T细胞亚群TH17细胞介导的炎症细胞浸润以及中枢神经脱髓鞘而引起的神经炎症疾病,但是其具体的发病机制尚不清楚。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化症的经典动物模型,被广泛用于自身免疫炎症的研究。包括TGF-β,IL-6,IL-1β以及IL-23在内的多种细胞因子均已经被证明可以诱导初始T细胞朝向不同亚型的极化。TH17亚型的的极化依赖于转移生长因子ROR-γt的表达水平,而转移生长因子ROR-γt的表达又依赖于STAT3,NF-κB等上游信号的诱导。小白菊内酯又称为欧柑菊。它的主要结构是一种倍半萜烯内酯,主要来自于药用菊科植物化学萃取。由于小白菊内酯拥有独特的化学结构,使得它本身对炎症的抑制作用,对肿瘤活性杀伤作用得到了空前的研究热度。但是小白菊内酯对中枢神经系统脱髓鞘疾病的作用尚不清楚。研究目的:本课题从体内探究小白菊内酯对实验性自身免疫性脑脊髓炎的预防与治疗作用。观察给药后中枢神经系统中浸润的炎性细胞数量以及脱髓鞘程度;从体外探究小白菊内酯对T细胞亚型TH1、TH17细胞在炎症反应过程中,分泌代表性炎症因子的影响情况,及其对NF-κB、ROR-γt分子信号通路的作用情况。研究其对实验性自身免疫性脑脊髓炎的预防与治疗作用和分子机制。研究方法:本实验分体内和体外两部分来进行研究。体内动物实验部分,以髓鞘少突细胞糖蛋白肽(MOG)为抗原构建实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)动物模型。同时将模型分为预防组、治疗组、与对照组三组。预防组与治疗组分别给予不同剂量的小白菊内酯进行腹腔注射,同时对照组给予2%DMSO溶液进行腹腔注射。从第一天起,每天观察EAE小鼠的疾病发生情况并记录临床评分。在EAE模型小鼠发病高峰期,取脊髓石蜡包埋、切片,进行苏木精-伊红染色以及固蓝染色,比较不同组间炎性细胞的浸润情况及脊髓髓鞘脱失程度。同时,在EAE鼠发病高峰期取中枢免疫器官与外周免疫器官,通过流式细胞术对小鼠的脊髓、脾脏、淋巴结中的CD4~+T细胞亚群进行分析。研究小白菊内酯对炎性相关细胞数量变化的影响。利用实时定量PCR对CD4~+T细胞亚群的相关细胞因子m RNA水平进行了检测。体外部分,使用Jurkat细胞系做了小白菊内酯处理后相关信号通路的研究。用Western blot的手段对NF-κB、ROR-γt、STAT3等信号进行了检测。研究结果:用小白菊内酯预防与治疗的EAE小鼠,发病情况明显得到改善,和对照组相比评分明显降低。预防组小鼠的发病率明显降低。脊髓石蜡包埋切片组织化学染色显示,和对照组相比,小白菊内酯处理组中枢神经系统中炎症细胞浸润数量明显减少,髓鞘脱失程度也明显减弱。流式细胞术观测发现中枢浸润的CD4~+T细胞数量有明显减少,其他炎症细胞亚群浸润数量无明显差异。同时发现中枢浸润的CD4~+T细胞亚型TH17细胞数量也显著减少。外周免疫器官脾脏和淋巴结中TH1和TH17细胞数量显著减少。实时定量PCR结果显示,TH1和TH17细胞分泌的特异性细胞因子如IFN-γ、IL-17A、IL-17F等在中枢浸润的单核细胞、脾脏和淋巴结细胞中的表达水平也受到明显抑制。研究结论:小白菊内酯可以改善EAE疾病发生程度,可以降低临床评分。组织化学染色分析,小白菊内酯可以减少中枢神经系统中炎症细胞浸润数量,可以减轻神经脱髓鞘程度。还能减少EAE小鼠中枢浸润单核细胞、淋巴结细胞、脾脏细胞中的TH1和TH17细胞数量。小白菊内酯是NF-κB信号的抑制剂,可以抑制IκB的磷酸化,从而减少c-Rel、p65进入细胞核,使得ROR-γt的转录水平受到抑制,从而抑制TH17细胞极化。由于小白菊内酯对EAE发病情况的改善作用,可以考虑将其作为多发性硬化症治疗的前药进行开发。