研究背景随着经济发展、生活水平的提高,生活方式的改变和生活节奏的加快,肥胖的发病率近年来呈现急剧上升的趋势,并且由肥胖导致的代谢紊乱疾病的发病率也随之增加,肥胖及其相关疾病的研究已经成为医学界和营养学界关注的热点之一。近年来的研究表明,脂肪组织不仅可以储存能量,还具有内分泌的功能。脂联素(adiponectin, APN)是近年来新发现的由脂肪细胞分泌的细胞因子,在调节糖代谢和能量平衡、改善胰岛素敏感性和抗动脉粥样硬化等方面的作用倍受关注。n-6和n-3系列多不饱和脂肪酸(PUAFs)在调节糖脂代谢和脂肪细胞分化中发挥重要作用,现有研究也大多数支持改变膳食脂肪酸构成能够改善由肥胖引起的相关代谢性疾病,并且观察到总是伴随着体内脂联素水平的改变。但n-6/n-3多不饱和脂肪酸构成对脂联素的调节作用尚不明确。研究目的本实验拟通过体外培养的3T3-L1脂肪细胞为研究对象,观察不同比例、不同浓度的n-6/n-3多不饱和脂肪酸构成对脂联素表达的影响,发现能提高脂联素表达的适宜脂肪酸比例和浓度,并初步探讨n-6/n-3多不饱和脂肪酸调节脂联素表达的分子机理。其研究结果将为肥胖相关疾病的预防和治疗提供新的思路和科学依据,也为确定膳食中n-6/n-3脂肪酸的适宜构成提供新的重要的参考依据,有重要的理论价值和现实意义。研究方法1.以体外培养并诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞为研究对象,n-6系的亚油酸(Linoleic acid, LA)、n-3系的二十二碳六烯酸(Docosahe--xaenoic acid, DHA)为受试物,观察经不同比例(LA/DHA为1：1,5：1,10：1,20：1和30：1)；一定浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的LA、DHA处理后,3T3-L1脂肪细胞脂联素及PPARγ基因表达水平的变化(Realtime PCR相对定量法),观察各受试物是否通过PPARγ来影响脂联素的表达；2.观察经不同比例(LA/DHA为1：1,5：1,10：1,20：1和30：1)；一定浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的LA、DHA处理后,3T3-L1脂肪细胞脂联素蛋白表达水平的变化(western-blotting相对定量法)；3.所得数据采用平均数±标准差(x±s)表示,采用统计软件SPSS13.0分析。如果方差齐,组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA),两两比较采用LSD T-test或dunnett T-test,如果方差不齐,运用Welch法和Dunnett’s T3法分别进行组间比较和两两比较。相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异显著。研究结果1. n-6/n-3PUFAs构成对脂联素及PPARy mRNA表达的影响1.1n-6/n-3PUFAs为1：1时对脂联素及PPARγ mRNA表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(1：1)分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,各浓度组脂联素mRNA表达均增加,分别比对照组增加118.18%(p=0.001)、152.73%(p=0.000)、154.55%(p=0.000)、56.36%(p>0.05)、38.18%(p>0.05)；在25、50、100μmol/L时表达增加最显著。在浓度为50、100μmol/L时,PPARγ mRNA表达显著增加,与对照组相比分别增108.33%(p=0.008)和80.56%(p=0.045)；其余浓度表达无显著差异。经Pearson相关分析,脂联素mRNA表达与PPARγ mRNA表达总体趋势存在显著正相关关系。相关系数r=0.863,P=0.000。1.2n-6/n-3PUFAs为5：1时对脂联素及PPARγ mRNA表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400gmol/L)的n-6/n-3PUFAs(5：1)分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,在浓度为25、50、100μmol/L时,脂联素mRNA的表达均高于对照组,在25μmol/L时最为显著,比对照组增加66%(p=0.000)；随着浓度的增加,脂联素mRNA表达下降,在400μmol/L时显著低于对照组,减少78%(p=0.000)。在浓度为25、50gmol/L时,PPARy mRNA的表达增加,在50μmol/L显著增加,比对照组增加64.36%(p=0.003)；随着浓度的继续增加,PPARy mRNA表达均下降,在200、400gmol/L时,分别比对照组减少44.55%(p=0.029)和55.45%(p=0.008)。经Pearson相关分析,脂联素mRNA表达与PPARy mRNA表达总体趋势存在显著正相关关系。相关系数r=0.590,P=0.010。1.3n-6/n-3PUFAs为10：1时对脂联素及PPARy mRNA表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(10：1)分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,在浓度为50gmol/L时脂联素mRNA的表达显著增加,比对照组增加50.85%(p=0.019)；其他浓度组PPARy mRNA表达均下降,当浓度为200、400μmol/L时,表达显著下降,比对照组分别减少13.56%(p=0.001)和77.97%(p=0.001)。在浓度为50μmol/L时, PPARγ mRNA的表达比对照组增加38.10%(p>0.05)；其他浓度组PPARγ mRNA表达均下降,当浓度为400μmol/L时,表达显著下降,比对照组减少65.48%(p=0.003)。经Pearson相关分析,脂联素mRNA表达与PPARγ mRNA表达总体趋势存在显著正相关关系。相关系数r=0.791,P=0.000。1.4n-6/n-3PUFAs为20：1时对脂联素及PPARγ mRNA表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(20：1)分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,与对照组相比,在浓度为50μmol/L时,脂联素mRNA的表达增加,但无显著差异；其他浓度组脂联素的表达均下降,当浓度为200、400μmol/L时,表达显著下降,比对照组分别减少13.56%(p=0.004)和77.97%(p=0.002)。在浓度为50μmol/L时,PPARγ mRNA的表达增加,但无显著差异；其他浓度组PPARγ mRNA表达均下降,当浓度为200、400μmol/L时,表达显著下降,比对照组分别减少50%(p=0.004)和60.29%(p=0.001)。经Pearson相关分析,脂联素mRNA表达与PPARγ mRNA表达总体趋势存在显著正相关关系。相关系数r=0.970,P=0.000。1.5n-6/n-3PUFAs为30：1时对脂联素及PPARγ mRNA表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(30:1)分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,与对照组相比,各浓度组脂联素的表达均下降,随着浓度的增加,下降趋势越明显,当浓度为50、100、200和400μmol/L时,表达显著下降,比对照组分别减少44.83%(p=0.012)、49.14%(p=0.006)、48.28%(p=0.008)和63.97%(p=0.001)。与对照组相比,各浓度组PPARγ mRNA的表达均显著下降,随着浓度的增加,下降趋势越明显,比对照组分别减少27.59%(p=0.001)、22%(p=0.001)、37%(p=0.000)、50%(p=0.000)和56%(p=0.000)。经Pearson相关分析,脂联素mRNA表达与PPARγ mRNA表达总体趋势存在显著正相关关系。相关系数r=0.793,P=0.000。2. n-6/n-3PUFAs构成对3T3-L1脂肪细胞脂联素蛋白表达的影响2.1n-6/n-3PUFAs为1：1时对脂联素蛋白表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(1:1)分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,与对照组相比,各浓度组脂联素的表达均增加,50、200、400μmol/L处理组脂联素蛋白表达与对照组相比略有升高,但无统计学差异(p>0.05)；25、100μmol/L处理组对照组相比,脂联素蛋白表达分别显著增加24.77%(P<0.05)、28.50%(P<0.05)。2.2n-6/n-3PUFAs为5：1时对脂联素蛋白表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(5：1)分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,与对照组相比,除400μmol/L浓度组脂联素蛋白的表达略有降低(5.88%)外,其他各浓度组脂联素蛋白的表达均增加,50、100、200μmol/L处理组脂联素蛋白表达与对照组相比略有升高,但无统计学差异(p>0.05)；25μmol/L处理组对照组相比,脂联素蛋白表达显著增加15.11%(P<0.05)。2.3n-6/n-3PUFAs为10：1时对脂联素蛋白表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(10：1)分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,与对照组相比,在浓度为25、50、100gmol/L时,脂联素蛋白的表达均高于对照组,在100gmol/L时最为显著,比对照组增加14.32%(P<0.05)；随着浓度的增加,脂联素蛋白的表达下降,在400μmol/L时显著低于对照组,减少16.21%(P<0.05)。2.4n-6/n-3PUFAs为20：1时对脂联素蛋白表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(20:1)分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,与对照组相比,在浓度为25、50、100、200μmol/L时,脂联素蛋白的表达无显著差异,随着浓度的增加,脂联素蛋白表达下降,在400μmol/L时显著低于对照组,减少26.57%(P<0.05)。2.5n-6/n-3PUFAs为30：1时对脂联素蛋白表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-6/n-3PUFAs(30:1)分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,与对照组相比,各浓度组脂联素蛋白的表达均降低,在50、100、200、400gmol/L时显著低于对照组,分别减少51.54%(P=0.000)、52.04%(P=0.000)、62.34%(P=0.000)、61.93%(P=0.000)。结论1.n-6/n-3PUFAs构成比的不同对3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的影响不同,在n-6/n-3PUFAs构成比为1：1和5：1时显著上调脂联素的表达,随着n-6/n-3PUFAs构成比的增加,对脂联素表达的促进作用逐渐下降,在30比1时完全抑制脂联素的表达。2.在一定浓度范围(25、50、100μmol/L)内,n-6/n-3PUFAs能上调3T3-L1脂肪细胞脂联素的表达,呈剂量依赖关系；在200μmol/L浓度以上时多呈现为抑制脂联素表达。n-3PUFAs比n-6PUFAs更能促进脂联素的表达。3.经相关性分析发现,脂联素与PPARy基因表达之间存在显著正相关关系,提不n-6/n-3PUFAs影响脂联素的表达有可能通过激活或抑制PPARγ的表达来实现。4.本研究结果提示脂肪酸的构成、浓度等都是影响脂联素表达的重要因素,n-6PUFAs在适当范围(n-6/n-3PUFAs为1：1和5：1)内可能上调脂联素PPARγ基因的表达,但是随着n-6/n-3PUFAs比例的增加主要表现为抑制作用,而n-3PUFAs则主要表现为上调脂联素和PPARγ基因的表达,由此可以推测可以通过调整膳食脂肪酸n-6/n-3PUFAs构成比、浓度等来增加脂联素的表达和分泌,发挥其有益作用。