肾移植是治疗肾功能衰竭的一种重要手段。在肾移植中,使用免疫抑制剂性药物进行辅助治疗,可以使肾移植术后一年移植肾存活率大大提高,最高可达到90%以上。排斥反应导致移植肾功能丧失的重要原因。目前解决的方法主要是通过不同的手段诱导机体产生免疫耐受。诱导移植免疫耐受的机制主要包括：阻断T细胞激活途径,诱导T细胞发生凋亡,使其功能丧失或者抑制其功能；诱导具有免疫抑制功能的调节性T细胞生成。诱导针对供者的特异性免疫耐受是肾移植领域的一个重要研究内容。国内外研究人员经过多年努力得到了许多研究数据,但是具体的机制目前仍未完全被揭示。近几年的研究表明,CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、调节性T细胞等多种淋巴细胞都具有调节和免疫抑制作用。其中,CD4+CD25+ Tregs被证明可以诱导免疫耐受。调节性T细胞可能主要作用于移植抗原的间接识别途径。调节性T细胞之所以能够有效诱导耐受,是因为它不仅能识别相同的同种移植抗原,还可识别其他的供者特异性抗原。此外,调节性T细胞能产生“关联抑制”的现象,即间接识别途径产生的调节性T细胞可以抑制直接途径和间接途径诱发的免疫反应。研究表明CD4+CD25+调节性T细胞具有免疫抑制功能,可以有效调节自身反应性T细胞的功能,从而维持机体的免疫耐受,减少自身免疫疾病的发生。因而,揭示CD4+CD25+调节性T细胞功能,对于器官移植免疫耐受研究有重要的意义。FOXP3是(forkhead winged helix protein family)转录因子家族的成员。它是CD4+CD25+调节性T细胞的表面标记物,其功能主要是调控CD4+CD25+ Treg的发育和生物学功能。CD4+CD25+ Tregs的其他表面标记物,如CTLA的表达水平,也受到FOXP3的调控。FOXP3主要在CD4+CD25+调节性T细胞中表达,仅有少数的CD4+CD25-细胞和CD8+细胞表达FOXP3。白细胞介素35 (Interleukin 35, IL-35)是白细胞介素12(IL-12)家族中的一个新成员,是由调节性T细胞(Regulatory T-cells,Treg)分泌的一种抑制性细胞因子,近年来逐渐成为免疫研究领域的热点。和IL-12家族的其他成员相似,IL-35也是由α和β两个亚基组成的异源二聚体。α亚基是EB病毒诱导基N3(Epstein Barr virus induced gene 3, EBI3),β亚基是p35亚基。IL-35可以调控调节性T细胞和B细胞的功能,具有免疫抑制功能。IL-35在体外能直接抑制效应性T细胞增殖的作用。而且,调节性T细胞中IL-35的表达水平与其抑制能力密切相关。研究表明,IL-35缺陷小鼠体内的调节性T细胞的抑制功能下调。与野生型调节性T细胞相比,IL-35缺陷的调节性T细胞不能控制效应性T细胞的增殖。此外,上调IL-35表达能促进CD4+CD25+ Tregs增殖,抑制CD4+CD25T细胞增殖。体外和体内实验均表明,IL-35均能抑制Thl7细胞的分化,抑制IL-17分泌,增强IFN-γ的表达。IL-35处理初始T细胞后,初始T细胞可被诱导转化成为诱导型调节性T细胞,这种细胞被命名为iTR35。iTR35具有免疫抑制功能,而且这种功能具有IL-35依赖性,但是不依赖于IL-10或TGF-β。iTR35可以调节感染耐受,促进T细胞介导的肿瘤进展。IL-35可以上调抗炎症的细胞因子表达水平,诱导CD4+Tregs的产生,抑制CD4+效应性T细胞以及其他靶标细胞,抑制炎症相关疾病和自身免疫性疾病的进展。IL-35在诱导型调节性T细胞发挥对CD4+和CD8+细胞的抑制功能中发挥重要作用。人鼻病毒激活的树突状细胞能诱导T细胞产生和分泌IL-35,从而抑制成熟CD4+和CD8+细胞的功能。IL-35能诱导CD4+CD39+CD25+T细胞过表达IL-10,同时抑制IFN-γ、IL-6和IL-17的表达。IL-35能促进CD4+CD25+Tregs增殖,可能在避免肝内损伤中起到保护作用。综上所述,IL-35可以有效改变调节性T细胞的。但是对其相关的器官移植排斥反应的抑制,比如肾移植排斥反应的抑制机制,还尚未可知。白细胞介素10 (Interleukin 10, IL-10)是一种免疫抑制因子。由Th2细胞分泌,能够抑制Thl细胞中IL-2和IFN-γ的合成。早期被命名为细胞因子合成抑制因子(CSIF),这种因子后来被命名为IL-10。研究表明IL-10有多种生物学作用。其中最引人瞩目的是,IL-10对不同类别的细胞都具有免疫调控作用,包括胸腺细胞,T细胞,B细胞,自然杀伤细胞(NK),单核细胞,巨噬细胞,肥大细胞,中性粒和嗜酸性细胞。最近的研究表明,几乎所有单核巨噬细胞都是IL-10抑制性作用的靶细胞。它抑制单核巨噬细胞维持天然和特异性免疫的功能,同时增强这些细胞抑制,免疫耐受诱导和清除功能。此外,它增强抗炎性因子释放,如IL-1受体拮抗剂和溶解性TNF-α受体。因此,IL-10可抑制多种天然免疫中重要细胞因子的作用。此外,IL-10抑制单核巨噬细胞的抗原递呈作用。它能减少IFN-γ诱发的MHC Ⅱ分子和共刺激分子、粘附分子的表达。IL-10可以直接作用于T细胞,不依赖于其对抗原呈递细胞的抑制。IL-10抑制CD4+T细胞的增殖和细胞因子合成,包括抑制Thl细胞产生IL-2和IFN-γ,以及抑制Th2细胞产生IL-4和IL-5。IL-10能够阻止B细胞凋亡,增强它们的分化、增殖和MHC Ⅱ类分子表达,并在免疫球蛋白种类转换中有促进作用。此外,IL-10刺激自然杀伤细胞的细胞毒活性,增加自然杀伤细胞对IL-2诱导的细胞因子分泌如：IFN-γ、GM-CSF和TNF-α,它还能够增加IL-2引起的CD56阳性自然杀伤细胞的增殖。本研究的目的是探讨IL-35对肾移植大鼠模型免疫耐受的影响及其分子机制。首先,我们检测IL-35干预后CD4-T细胞、CD8-T细胞、CD4+CD25+Treg、 FOXP3+细胞、CD4+CD25+FOXP3+Tregs百分比的变化,评价血清肌酐和细胞因子、以及形态病理学等指标,从而分析IL-35对正常SD大鼠的作用,为下一步研究IL-35对肾移植大鼠模型免疫耐受的影响及其分子机制提供一定的研究基础和客观依据。其次,本研究通过重组鼠IL-35处理肾移植大鼠模型,在移植5、14天时取全血、肾移植物和脾脏检测血清肌酐和细胞因子的表达水平；通过流式细胞术检测CD4T细胞、CD8-T细胞、CD4+CD25+Tregs、FOXP3+细胞、CD4+CD25+FOXP3+Tregs的百分比变化,以及通过HE染色等手段观察移植物形态病理学变化；详细记录大鼠肾移植模型的生存期并分析IL-35对大鼠肾移植的作用；广泛而深入的探讨IL-35诱导大鼠同种异体肾移植模型免疫耐受的分子机制,为将来能在临床器官抑制中提供一定的研究基础和客观依据。本研究通过荧光定量PCR检测大鼠外周血中IL-10、TGF-β、FOXP3等细胞因子的mRNA表达水平；通过ELISA实验检测大鼠外周血中IL-2、IL-6、 IL-10、IL-17、IL-23、TGF-β的蛋白表达水平；通过免疫印迹检测大鼠肾组织和脾脏组织中FOXP3的蛋白表达水平。通过流式细胞术检测外周血中CD4-T细胞、CD8-T细胞、CD4+CD25+Tregs、FOXP3+细胞、CD4+CD25+FOXP3+Tregs的百分比。荧光定量RT-PCR检测结果和ELISA检测结果显示,IL-35处理可导致正常大鼠外周血中IL-10、TGF-β、FOXP3等因子的mRNA和蛋白表达水平显著升高。流式细胞术检测结果显示IL-35处理可导致正常大鼠外周血中CD4-T细胞、CD8-T细胞、FOXP3+细胞、CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25+FOXP3+Tregs百分比增加。为了研究IL-35对大鼠同种异体肾移植动物模型免疫耐受的影响,我们采用Wistar→SD大鼠构建了同种异体肾移植动物模型,SD→SD大鼠构建同种异体肾移植动物假模型,并给与了IL-35干预。实验分为5组：IL-35+模型组、PBS+模型组、IL-35+假模型组、PBS+假模型组和PBS+正常大鼠组。分别在移植后第5和第14天取各组大鼠血清,通过ELISA检测各组血清肌酐(Cr)和细胞因子(IL-2、IL-10、IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ、和TGF-β)水平。采用SPSS20.0进行统计学分析,以P≤0.05认为差异有统计学意义,采用Graph Pad绘图。ELISA检测结果显示,第五天时IL-35干预导致模型组Cr (F=276.869, P<0.001)、IL-6 (F=3411.957, P<0.001)、IL-17 (F=173.206,P<0.001)、IL-23 (F=109.609, P<0.001)、IFN-γ (F=800.145, P<0.001)、和TGF-β (F= 122.876,P<0.001)水平下降(N=3), IL-2 (F=39.471, P<0.001)和IL-10(F=151.537,P<0.001)水平升高(N=3)(图1)。第14天时,IL-35干预导致模型组Cr(F=532.881, P<0.001)、IL-6(F=158.974, P<0.001)、IL-17(F=35.642, P<0.001)、 IL-23 (F=87.057, P<0.001)、IFN-γ (F= 190.986, P<0.001)、和TGF-β (F=45.276, P<0.001)水平下降(N=3), IL-2 (F=133.488, P<0.001)和IL-10 (F=274.343,P<0.001)水平升高(图2-2)(N=3)。荧光定量PCR结果显示第5天时,不管是在正常组还是在肾移植模型组,IL-35干预后,FOXP3、IL-10和TGF-β的mRNA表达水平均显著上调：F值分别为F=21.289、F=17.737、F=188.327,P值分别为P<0.001、P<0.001、P<0.001(N=3)。第14天时得到的检测结果与第5天的结果相似,IL-35干预后,FOXP3、IL-10和TGF-β的mRNA表达水平均显著上调,F值分别为F=23.502、F=70.242、F=11.184,P值分别为P<0.001、P<0.001、P<0.001(N=3)。荧光定量PCR结果显示,不管是在正常组还是在肾移植模型组,IL-35干预后,肾组织中FOXP3、IL-10和TGF-β的mRNA表达水平均显著上调；F值分别为F=115.560、F=82.594. F=36.138,P值分别为P<0.001、P<0.001、P<0.001 (N=3).流式细胞术检测结果显示,第5天时IL-35+模型组、PBS+模型组、IL-35+假模型组、PBS+假模型组和PBS+正常大鼠组,它们外周血中CD4+Treg百分比分别为：40.5%、28.19%、43.69%、47.06%和41.73%；CD8+Tregs百分比分别为：26.18%、18.08%、27.92%、25.59%和21.77%；CD4+CD25+Tregs百分比分别为：5.69%、4.51%、5.06%、5.34%和5.19%。第14天时IL35+模型组、PBS+模型组、IL-35+假模型组、PBS+假模型组和PBS+正常大鼠组,它们外周血中CD4+Tregs百分比分别为：48.04%、28.81%、51.74%、50.9%和50.49%;CD8+Tregs百分比分别为：25.5%、25.08%、23.14%、22.58%和23.61%；CD4+CD25+ Tregs百分比分别为：5.44%、4.48%、4.93%、5.04%和4.83%。这说明IL-35干预显著提高大鼠外周血中CD4+、CD8+和CD4+CD25+Tregs百分比。综上所述,IL-35通过调控CD4+CD25+FOXP3+Tregs参与大鼠同种异体肾移植模型免疫耐受。