青光眼(glaucoma)是一组复杂的、慢性进行性前部视神经损伤性眼病,主要临床特点为眼压升高、视乳头杯状凹陷、萎缩及视神经纤维束性视野缺损。在全球是仅次于白内障的导致视力损害和致盲的主要原因。并且,随着预期平均寿命的延长,发病率可能还要提高。由于青光眼所导致的视野缺损乃至失明是不可逆的,因此危害很大。其中原发性开角型青光眼(primary open-angleglaucoma,POAG)是最常见的青光眼类型。由于POAG发病隐匿,进展较缓慢,故不易被察觉。早期一般无任何症状,等患者发现已至中晚期,所以也是最危险的类型之一,因此,POAG正日益成为青光眼防治工作的重点。目前尚未找到有效的办法对其彻底预防和根治,已成为眼科界面临的棘手的医学难题。　　 POAG根据发病年龄的早晚分为40岁以后发病的成年型原发性开角型青光眼(adult—primary open-angle glaucoma,adult-POAG)和35岁以前发病的青少年型原发性开角型青光眼(Juvenile-onset open angle glaucoma,JOAG)。由于患者视神经损害是不可逆的,所以早期诊断、早期治疗更受到临床医生的重视,在自然人群中筛查青光眼患者是早期发现青光眼的切实可行的重要手段。　　 近年来对POAG家系中高危个体及阳性家族史患者进行遗传学筛查,对POAG的早期诊断以及随访观察提供了有效的方法。　　 目前对于POAG的病因的认识尚不完全清楚,多数学者认为POAG是一种多因素性视神经病变。由于POAG发病具有家族性,亲属中的高发性及对双生子的研究表明遗传因素在青光眼的发病中起着重要作用,最近一些研究显示某些基因的缺陷是导致青光眼的病因。　　 POAG的遗传学研究已有100多年的历史,80年代后期分子遗传学研究方法的出现,使POAG的分子遗传学研究成为研究的热点。研究发现POAG有高度的遗传异质性,MYOC基因突变是POAG家系最常见的致病基因突变,由此MYOC基因成为国内外学者对POAG家系及散发患者研究的热点基因。国内外众多学者对不同种族的POAG家系患者MYOC基因的突变进行了筛选及序列分析,发现在不同种族的人群中具有不同的MYOC基因突变位点,且突变频率也有较大差异,迄今,发现至少有70多个MYOC基因突变位点与POAG发病有关,约有90％以上位于第三外显子,不到10％的突变发生在第一外显子,还未有与第二外显子相关的致病基因突变。提示第三外显子为突变热点区域。近十年来国内共报道MYOC基因突变十余种,其中POAG家系中发现的MYOC突变绝大多数仅存在于家系成员中,散发患者中发现的MYOC突变多数也只存在于亚洲人群中,由此说明我国MYOC基因突变存在一定的种族特异性,但国人是否还存在MYOC基因其他突变形式以及家系中携带致病基因突变患者的临床特点怎样等问题均需要进一步研究。这一观点为我们的研究开辟了一个新的思路。　　 为探讨中国人的MYOC基因缺陷特点,我们对一个中国POAG家系进行分析,希望用分子生物学、医学遗传学、生物信息学技术,在这个原发性开角型青光眼家系中筛选出发生原发性开角型青光眼的MYOC基因的新的突变位点,并探讨其可能的作用机制,为POAG的发生发展寻找到新的研究途径,为POAG的治疗寻找到新的靶点,本课题按一下思路进行。　　 目的　　 1.通过对一个中国原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucomaPOAG)家系的MYOC基因序列的突变分析,探讨POAG患者MYOC基因突变特点,进一步证实MYOC基因的突变是POAG临床显性的病因,为POAG的基因诊断提供理论依据,对进一步研究MYOC基因在POAG发生中所起的作用奠定基础。　　 2.探讨该家系基因型与临床表型之间的关系；分析青光眼发病的危险因素中遗传因素对家系成员发病的影响,为后续研究工作奠定基础,为原发性开角型青光眼(POAG)的发生发展治疗寻找新的研究途径；　　 3.分析该家系中MYOC基因突变患者的蛋白质二级结构可能的改变形式。寻找该POAG家系MYOC基因突变患者及携带者产生青光眼的分子遗传学依据。　　 材料与方法　　 1.临床资料和诊断　　 研究对象为中国中原地区经过密切临床观察5年的一POAG家系,由于两个分支家系成员在遥远省份及国外生活,故未对其进行实地临床和实验室检查。其余家系成员及其配偶均为汉族,非近亲婚配。根据临床检查结果将家系成员分为青光眼患者、可疑者、无明显青光眼体征者3类。对青光眼的诊断需同时具有特征性青光眼视神经病变,特征性青光眼视野缺损和高眼压(压陷式眼压计测量大于21mmHg,1mmHg=0.133kPa)3项异常。异常少于3项的人诊断为青光眼可疑者。特征性视神经病变的诊断标准为:视神经杯盘比≥0.7,双眼杯盘比差值>0.2,视盘边缘变薄,局灶性切迹或盘沿缺失。选择100名无青光眼病史及家族史,无其他内眼病史的健康人作为对照。　　 于门诊组织现有POAG家系成员,家系中共有5代29人现有成员共有4代25人,第一代患者的父母已病故,死因不详,但在世时都没有明确的青光眼病史。参加研究的人员共有3代12名成员,对先证者及部分家系成员进行视力、压陷式眼压计测量眼压、前房角镜、眼底照相和Octopus视野等检查,其余成员回顾历史检查记录及参照当地检查结果。应用系谱分析法确定该家系的遗传模式。　　 2.基因组DNA提取　　 在知情同意的基础上,分别抽取家系中各个成员的外周静脉血样,对照组DNA来源于100名无青光眼病史及家族史,无其他内眼病史的健康人,采用标准酚/氯仿法提取基因组DNA。　　 3.设计并合成候选基因引物　　 根据MYOC基因序列,按照引物设计的原则,使用Primer3软件对第3外显子进行引物设计。由基因技术公司合成MYOC基因第三外显子及外显子内含子连接区引物,　　 4.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)　　 对家系中的患者应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增MYOC基因。PCR反应体系20μl　　 10×PCR Reaction Buffer(含20Mm Mg2+)2μl　　 dNTPs(10 mmol/L)0.5μl　　 上下游引物(各10pmol/μl)各0.5μl　　 Taq DNA聚合酶(2U/μl)0.5μl　　 模板基因组DNA(5-50ng/μl)2μl　　 双蒸水14μl　　 在扩增仪上进行扩增反应。PCR反应条件为:(1)94℃预变性5min;(2)94℃变性30s；退火30-60s；72℃延伸30-60s；共循环30-36次；(3)72℃延伸10min。并用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。4℃保存。　　 5.PCR产物纯化并测序　　 抽取5-6μl正向或反向引物,同时将扩增良好的PCR产物及相应的引物进行纯化并测序。将测序结果与MYOC基因第三外显子正常序列比对,检测患者突变位点的碱基改变。　　 6.限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析　　 用两种限制性内切酶反应体系及条件对“家系成员及100个正常对照个体”行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析。酶反应结束后,取10μl酶切产物于1％琼脂糖凝胶(含EB)100v电泳40分钟,紫外灯下观察酶切条带,分析酶切位点及酶反应片断。　　 7.利用GOR蛋白质二级结构预测方法(GOR secondary structure predictionmethod)对野生蛋白和突变蛋白进行蛋白质二级结构分析；用BLAST方法进行蛋白质的同源性分析。　　 结果　　 1.POAG家系调查结果:POAG家系(编号为F1)成员共有5代29人,现有成员25人,其中男性11人,女性14人,POAG的遗传方式符合常染色体显性遗传模式。家系成员中共有12名成员参加了本研究,接受DNA检测,其中男性5人、女性7人；受检人员中3人为POAG患者(男性2人,女性1人),1人为POAG可疑者,临床检查基本正常或无明显体征者8名。　　 2.POAG家系受检患者MYOC基因DNA测序:对家系中患者MYOC基因第三外显子行PCR扩增后直接测序,发现位于第三外显子的杂合性碱基突变c.1021T>C(P.S341P),密码子由TCC变成CCC(TCC->CCC),导致该密码子所翻译的氨基酸的改变,相应myocilin蛋白第341位氨基酸由丝氨酸变成脯氨酸(丝氨酸->脯氨酸)(p.S341P),通过对12例家系成员的DNA样品测序,在6名成员中发现同样的突变。家系成员中所有突变携带者均为杂合子。相关功能学研究证明该突变为致病基因突变。　　 3.携带致病基因突变的POAG患者基因型与临床表型之间存在一定的关系:在6位携带该突变的家系成员中3人为POAG患者,男2人、女1人,年龄为32～82岁(平均58.33岁)。1人为可疑POAG患者,为女性,年龄为55岁。2例为无明显体征者,男、女各1人,年龄为41～44岁(平均42.5岁),POAG患者的确诊年龄为25～60岁(平均45岁),最高眼压值为42～52mmHg(平均46.33mmHg),目前均行小梁滤过性手术以控制眼压。无c.1021 T>C(P.S341P)突变的家系成员临床检查均正常。3名患者已行双眼小梁切除术,术后眼压控制可。　　 4.POAG家系受检者限制性内切酶分析结果:第三外显子出现杂合性碱基突变,该碱基改变后,丢失了一个限制性内切酶酶切位点(CviKI-1),从而此点不能被限制性内切酶所识别。家系中正常个体(除096006、096008、09609)和100个正常对照个体酶切结果表明一对正常的同源染色体均能被酶切开。　　 5.对野生型和突变型蛋白质进行二级结构预测及同源性分析:MYOC基因c.1021 T>C杂合性碱基改变造成myocilin蛋白第341位氨基酸由丝氨酸变成脯氨酸,氨基酸的理化性质发生了重大改变,势必会造成蛋白质二级结构的改变,影响其正确折叠。本研究利用GOR方法(http://npsa-pbil.ibcp.fr/)对野生型和突变型蛋白质二级结构进行了预测,结果表明:野生型myocilin蛋白第333、337、342位氨基酸处二级结构发生了改变,333位氨基酸处野生型的线圈结构被β-片层结构替代；337、342位氨基酸处都是野生型的β-片层结构被线圈结构替代；该处恰为线圈结构和片层结构的交界处,推测其可能造成myocilin蛋白的错误折叠。其同源性分析显示:第341位氨基酸在物种的进化中非常保守,该位点的特性是亿万年进化的结果,该位点的突变是自然选择所不容许的,可能会造成机体发病。　　 6.对照人群中MYOC基因突变的筛选结果:对100个正常对照个体进行筛查,未发现相同序列的改变。　　 结论　　 1.本研究通过对一个国人POAG家系的MYOC基因突变分析,发现了该家系的位于MYOC基因第三外显子的1个致病基因突变,证实该家系的POAG的患病与MYOC基因的突变有关,临床表现为混合发病年龄型POAG,为POAG的基因诊断提供理论依据,为进一步研究myocilin蛋白的功能奠定了基础。　　 2.对家系成员基因型与临床表型的关系进行了分析,有助于疾病的早期诊断和遗传咨询的开展；对家系成员突变阳性而尚未发病者应进行密切临床观察,以期早期诊治,挽救患者视力。分析青光眼发病的危险因素中遗传因素对家系成员发病的影响,为后续研究工作奠定基础,为原发性开角型青光眼(POAG)的发生、发展、治疗寻找新的研究途径；　　 3.对家系人员及正常对照的血样进行限制性片段长度多态性进行分析,进一步明确家系人员中的基因突变患者、可疑患者、基因突变携带者及正常人。　　 4.对家系人员Myocilin蛋白的野生型、突变型蛋白质二级结构进行突变预测及同源性分析,推测该突变可能造成myocilin蛋白的错误折叠,使其疏水性改变,可溶性降低,从而阻塞小梁网,影响房水外流。其同源性分析显示:第341位氨基酸在物种的进化中非常保守,该位点的特性是亿万年进化的结果,该位点的突变是自然选择所不容许的,可能会造成机体发病。这为青光眼的发病和临床表型查找了病因。寻找了该POAG家系MYOC基因突变患者及携带者产生青光眼的分子遗传学依据。　　 5.对携带致病基因突变患者的一级亲属进行基因诊断,有助于疾病的早期诊断和早期治疗。