葡萄球菌肠毒素B(SEB)是金黄色葡萄球菌(金葡菌)产生的一种超抗原,具有极大的毒性,可以在很低的浓度下激活大量的CD4~+T细胞。而细胞因子的大量产生会引发“细胞因子风暴”,进而导致急性毒性效应。作为一种重要的肠毒素,SEB不仅是食物中毒的主要原因,也是潜在的生物威胁,可以被发展成一种气溶胶化的生物武器。同时,因为SEB具有较大的毒性、稳定性和易获得性,美国国家疾病控制中心将其列为生化武器清单上的重要致病毒素。因此,对SEB进行快速准确的检测是非常重要和迫切的。AlphaLISA是一种基于两个微球的技术。当这两种微球彼此接近时,用波长为680 nm的光激发供体微球产生能量,将周围反应体系中的氧分子转变为激发态,并将能量传递给受体微球,最终产生520~620 nm的荧光。该技术操作便捷,反应用时少,均相免洗,并具有较高的灵敏度。本实验建立了AlphaLISA检测SEB的方法。对结果进行分析,采用非线性回归法进行AlphaLISA标准曲线的建立,缓冲液中SEB检测的线性范围为25 pg/mL至25 ng/mL,LOD为25 pg/mL,具有较高的灵敏度。在模拟样品中,LOD可达50pg/mL,同时具有较好的耐受性,受到样品基质影响较小,稳定性高。在缓冲液和模拟样品中的批间CV和批内CV均小于10%,具有较好的重复性。该方法检测特异性高,不与其他经典的肠毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、相思子毒素等发生交叉反应。这对于确认SEB污染引起的食物中毒是非常重要的。在将AlphaLISA用于菌液上清中SEB的检测时,发现该方法几乎不受葡萄球菌蛋白A(SPA)的干扰。SPA是金葡菌免疫检测的主要干扰因素,能够与鼠,兔等哺乳动物抗体FC段产生高亲和力结合。而在本实验中,使用100μg/mL的SPA对SEB进行稀释并检测后发现,SPA对AlphaLISA的信号值几乎没有影响。因此AlphaLISA检测方法的建立不仅适用于食品样品中SEB的检测,同时,在金葡菌污染的食物样品中SEB含量较低时,也可以通过分离培养金葡菌,对菌液上清中的SEB进行检测。在AlphaLISA技术中,功能化的聚合物微球是其重要的材料。聚合物微球是指具有圆球形状,且粒径在数十纳米至数百微米尺度范围内的聚合物粒子。制备材料主要分为天然高分子和合成聚合物,如聚苯乙烯(PS)。而对微球的功能化的研究,一直是相关领域的重点。微球的功能化,现在已经有包括量子点化,荧光化,中空化,磁化等多种方法。商业化的AlphaLISA技术微球为国外公司制备,无法获得具体的合成方法和所含材料。但是随着荧光材料的发展和新型光敏剂的出现,该微球也出现了越来越多的改进空间。为了对微球性能的提升做准备,如何稳定的负载功能化材料就显着的尤为重要。本实验初步构建了通过溶胀法使PS微球负载荧光染料组合物的方法,并对合成的整体步骤进行了优化,在优化后的步骤下合成的微球,具有良好的重复性,CV值均小于10%。同时对溶胀的温度和时间进行了摸索,发现在80°C下溶胀15 min的微球信号值强度最佳。通过透射电镜观察了溶胀前的微球和不同温度下溶胀的微球的外部形貌,发现了80°C下溶胀的微球同溶胀前相比,分散性几乎没有变化。而90°C下的微球,发生了一定的程度的聚集重叠。透射电镜的结果,也揭示了80°C下溶胀效果更佳的一种可能原因。在对微球偶联抗体的步骤进行优化的过程中,探索了EDC的用量和偶联抗体的时间。根据结果显示,为了得到最优的活化效果和偶联效率,每5 mg微球需使用0.1 mg的EDC对其表面的羧基官能团进行活化,并且最佳的抗体偶联时间为2 h。通过溶胀法构建微球负载荧光染料的方法,已有了初步结果,能够较为稳定的实现微球的荧光化。为下一步对荧光染料的改进和应用,打下了良好的基础。