背景与目的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一种恶性克隆性血液系统肿瘤；随着新药和新型治疗手段的不断涌现,目前治疗方案能使约80%AML患者获得缓解,然而60%以上患者最终耐药复发,疾病5年总生存率不及40%。其根本原因在于白血病干细胞(leukemic stem cells, LSCs)对目前白血病化疗抵抗。LSCs在患者体内仅占0.01%-0.09%,具有自我更新、无限增殖和分化的干细胞特性,并对传统化疗药物耐药。目前认为LSCs的耐药机制主要包括：绝大部分LSCs处于休眠状态；LSCs能启动DNA自我修复机制,过表达药物外排泵ABC转运蛋白排出细胞内药物,逃避药物杀伤；LSCs存在细胞凋亡功能障碍,且多种信号通路(Hedgehog、AKT信号通路)异常激活等等。LSCs耐药是当前白血病治疗的瓶颈,有效清除LSCs是治愈白血病的最终目标,有必要寻求可供研究的LSCs细胞生物模型。我们前期的研究已经成功建立LSCs研究模型技术平台；我们发现,人急性髓系白血病细胞株KGla细胞膜表面表达CD34+和CD123+,与目前公认的LSCs免疫表型(即CD34+CD38-CD123+)特征一致；运用免疫磁珠分选技术(负选法),从KGla细胞株中分选出CD38-细胞(LSCs)。我们还发现,分选出的CD34+CD38-细胞大多数处于细胞周期静止期G0,具有分化增殖及体外克隆形成的能力,并能够在NOD/SCID、鼠体内克隆AML；对多种化疗药物耐药。因此,探索新的治疗策略,逆转LSCs耐药,直接靶向LSCs,有效清除LSCs是治愈白血病的关键。口服的多激酶抑制剂Sorafenib由德国拜耳公司开发研制,在短时间内获得美国FDA批准,成为治疗晚期肾癌和肝细胞癌的一线药物。近年来,学者们的研究发现,Sorafenib的作用并不仅限于抑制Raf激酶,它同时也是其他多种激酶的抑制剂,譬如,FLT3、c-Kit,生长因子受体等；因此,Sorafenib作为新型的抗肿瘤靶向药物广泛被推广,已用于肝癌、肺癌、急性髓系白血病等人类恶性肿瘤Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期临床试验。在临床前实验研究中,Sorafenib也突显了它在急性髓系白血病中杀伤肿瘤的作用。有研究发现,Sorafenib在不影响正常CD34+造血干细胞的前提下,能通过改变Bc12蛋白家族中Mcl-1和Bax蛋白的表达,诱导多种急性髓系白血病细胞株和原代白血病细胞发生线粒体途径凋亡。然而,众所周知,生存信号Hedgehog/AKT通路的异常激活对LSCs维持干细胞特性及多重耐药性至关重要,Sorafenib是否能通过阻断Hedgehog/AKT信号通路诱导LSCs线粒体途径凋亡,目前尚未明确。由此,我们设想Sorafenib通过下调Hedgehog/AKT信号通路杀伤LSCs,可有效清除患者体内残留的白血病细胞。本课题在前期研究基础之上,以CD34+CD38-LSCs为研究对象,Sorafenib为干预手段,探讨多激酶抑制剂Sorafenib对LSCs的作用及相关机制,为Sorafenib有效清除LSCs,治疗白血病提供实验基础和理论依据。方法第一章从KGla细胞株分选CD34+CD38-白血病干细胞采用免疫磁珠分选技术(负选法),从人急性髓系白血病KG1a细胞株中分离出CD34+CD38-细胞；流式细胞术检测细胞表面膜CD34和CD38抗原表达,分析分选的LSCs纯度。第二章Sorafenib诱导白血病干细胞线粒体途径凋亡1.以MTT实验检测不同浓度(0-801μM)的Sorafenib对LSCs的细胞毒作用；以PI为标记,流式细胞术检测不同时间点(0-24h)40μM Sorafenib干预LSCs的凋亡率；以细胞核染色(Hoechst33342染色)为实验方法,用激光扫描共聚焦显微镜从形态学上观察不同浓度(0-40μM)的Sorafenib诱导LSCs凋亡；Western blotting技术检测Sorafenib干预LSCs后线粒体凋亡途径关键蛋白Caspase9、Caspase3、PARP蛋白的表达变化；2.运用SPSS17.0软件进行数据分析,数据以均值±标准差(x±s)表示。多组均数比较采用单因素方差分析；方差齐时,组间多重比较采用LSD法,方差不齐时,组间多重比较采用Dunnett’s T3法；P<0.050为差异有统计学意义。第三章Sorafenib诱导白血病干细胞凋亡的相关机制采用Western blotting技术,分析Bcl2蛋白家族抗凋亡蛋白(Bcl2, Bcl-xl和Mcl-1)和促凋亡蛋白(Bax)以及Hedgehog/AKT信号通路的关键蛋白Gli1、 Gli2、p-Akt、Akt的表达改变。结果第一章从KG1a细胞株分选CD34+CD38-白血病干细胞采用免疫磁珠分选技术(负选法)从人急性髓系白血病KGla细胞株中成功分选出CD34+CD38-细胞；运用流式细胞术检测分选后细胞的纯度,结果显示：分选出的CD34+CD38-细胞所占比例高达93.950%。第二章Sorafenib诱导白血病干细胞线粒体途径凋亡1.Sorafenib能够影响白血病干细胞的活性MTT实验结果显示Sorafenib对CD34+CD38-LSCs有细胞毒作用,且呈剂量依赖性,表明CD34+CD38-LSCs对Sorafenib敏感。不同的浓度(0～80μM)Sorafenib作用于LSCs72h后,所测得不同浓度间细胞活性的差异有统计学意义(F=125.595,P=0.000)；当Sorafenib浓度为40μM时对LSCs的细胞毒作用最大。2.Sorafenib诱导白血病干细胞凋亡2.1流式细胞术检钡Sorafenib诱导白血病干细胞凋亡呈时间依赖性将对数期生长的LSCs暴露于40μM Sorafenib,不同时间点(0h、8h、12h、16h、24h)干预后进行流式细胞术检测,发现Sorafenib作用LSCs12h时已出现细胞凋亡,随着时间的增长,LSCs的凋亡发生率逐渐升高,时间点Oh、8h、12h、16h、24h凋亡率的差别有统计学意义(F=50.599,P=0.000)。其中,时间点16h、24h的凋亡率相对0h、8h、12h的差异有统计学意义(P=0.000)；时间点16h与24h之间的凋亡率的差异也有统计学意义(P=0.004)；时间点0h、8h、12h间的凋亡率差异无统计学意义(P>0.050)。2.2细胞核染色(Hoechst33342染色)检测白血病干细胞凋亡选取不同浓度(0-40μM)的Sorafenib干预LSCs72h后收集全部细胞进行细胞核染色(Hoechst33342染色),运用激光共聚焦显微镜观察发现：随着Sorafenib浓度增加,视野中细胞数越来越少,且细胞形态不规则；出现典型细胞凋亡的形态学改变：即细胞核出现浓缩,有些核裂解成多个凋亡小体；相比之下,对照组的细胞形态正常,可见细胞有丝分裂相。2.3Sorafenib诱导白血病干细胞线粒体途径凋亡提取不同时间点(0h、8h、12h、16h、24h)40μM Sorafenib处理后的LSCs总蛋白,采用Western blotting实验技术对细胞线粒体途径凋亡关键蛋白Caspase9、 Caspase3以及PARP的表达情况进行分析。实验结果显示：在各个时间点管家蛋白GAPDH表达量一致的情况下,随着时间的延长,①Caspase9蛋白激活,条带在47kDa处逐渐减少；②处于Caspase9下游的Caspase3也被激活参与细胞凋亡的发生,Caspase3蛋白在35kDa处表达量也呈现递减的趋势；③PARP蛋白同样被激活,在分子量89kDa处,cleave-PARP从12h开始表达逐渐增加。第三章Sorafenib诱导白血病干细胞凋亡的相关机制1. Sorafenib主要通过下调Bc12家族抗凋亡蛋白诱导白血病干细胞凋亡以Sorafenib40μM干预LSCs0h、8h、12h、16h、24h,收集细胞提取总蛋白,用Western blotting检测不同时间点作用于LSCs,线粒体途径凋亡关键调节因子Bc12家族蛋白表达的变化。实验结果显示：随着干预时间的延长,抗凋亡蛋白Bcl2, Bcl-xl和Mcl-1均出现表达量的减少,而促凋亡蛋白Bax并无明显改变。其中,Mcl-1最早受抑制,Bcl-xl其次,Bc12在三者中最后出现表达下降。2. Sorafenib可抑制白血病干细胞Hedgehog/AKT信号通路不同时间点Sorafenib40μM干预LSCs,采用Western blotting技术分析Hedgehog/AKT信号通路的关键蛋白表达变化；发现随着时间的增长,Gli1、Gli2、 p-Akt、Akt均呈递减趋势。结论1.人急性髓系白血病KGla细胞株中包含白血病干细胞,是白血病干细胞研究良好的细胞模型；采用免疫磁珠分选技术,成功从KGla细胞中分选出纯度极高、可供后续实验研究的白血病干细胞。2.白血病干细胞对Sorafenib敏感,Sorafenib对白血病于细胞的细胞毒作用呈剂量依赖性。3.Sorafenib可诱导白血病干细胞发生线粒体途径凋亡,它所诱导的白血病干细胞凋亡呈时间-剂量依赖性。4.Sorafenib主要通过下调Bcl2家族抗凋亡蛋白诱导白血病干细胞线粒体途径凋亡。5.Sorafenib可抑制白血病干细胞Hedgehog/AKT信号通路。