幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）能够引起胃炎、胃溃疡、胃癌等多种消化道相关疾病,世界卫生组织将其列为I类致癌物。根除幽门螺杆菌能显著减轻胃部炎症,促进溃疡愈合,并可能预防胃癌的发生。由于抗生素的过度使用甚至滥用,抗生素耐药菌株的流行率持续增加,导致幽门螺杆菌根除治疗效果下降。因此,在医疗机构中,除了一般的幽门螺旋杆菌诊断外,还需进行抗生素耐药性评估,以指导临床医生提供有效的治疗方案。但传统的体外药敏试验、E-test等耐药检测方法操作复杂,需要熟练的技术人员,且耗时长。近年新发布Maastricht V共识第一次提到“在活检标本上用分子诊断方法检测幽门螺杆菌及克拉霉素和/或氟喹诺酮类的耐药”,针对这一新的建议,本研究通过对幽门螺杆菌样品核酸提取,幽门螺杆菌克拉霉素和左氧氟沙星耐药核酸检测方法建立,幽门螺杆菌感染的临床样品检测三个方面进行研究,建立一种操作简便的Taq Man-MGB探针多重实时荧光定量PCR系统,用于实现一步诊断幽门螺杆菌感染和检测左氧氟沙星和克拉霉素耐药突变。第一部分是幽门螺杆菌检测最适取样部位和核酸提取方法研究。选取86例采集自胃镜检查患者唾液、牙菌斑以及胃黏膜三个不同部位的样品通过热裂解、离心柱法以及磁珠提取法对预处理后的样本进行核酸提取。通过建立两重q PCR扩增检测H.pylori 16S r DNA和人内参基因RPP30。实验结果表明,唾液、牙菌斑未检出幽门螺杆菌,胃黏膜样本与临床病理活检一致性100%。用三种提取方法对已知H.pylori阳性胃黏膜进行了核酸提取,通过比较核酸浓度和扩增Ct值,磁珠法提取核酸浓度（80-100 ng/μL）及后续扩增平均Ct值均优于热裂解法和离心柱提取法。第二部分是针对幽门螺杆菌的左氧氟沙星、克拉霉素耐药位点单重q PCR检测体系的建立。通过人工合成含野生型和耐药型突变基因序列的质粒,针对C261A/G、G271A/T和A272G突变型的左氧氟沙星耐药H.pylori gyr A以及A2142G/C和A2143G突变型的克拉霉素耐药H.pylori 23S r DNA合成不同的Taq Man-MGB探针,对引物、探针进行筛选验证单重q PCR扩增的可行性、特异性。结果表明,该系统能够准确区分具有不同突变标记的重组质粒。并且本方法特异性良好,检测含有左氧氟沙星、克拉霉素耐药突变位点的幽门螺杆菌可与其它8种同样引起胃肠道疾病的致病菌区分开。第三部分为多重q PCR体系建立及临床样本检测,整合引物和探针加入A、B两个反应管内建立了左氧氟沙星和克拉霉素耐药幽门螺杆菌Taq Man-MGB探针多重q PCR检测体系,并验证了该系统特异性、可行性和灵敏度。该系统对检测是否有幽门螺杆菌感染可以达到10~1 copies/μL,检测耐药突变位点可以达到10~2 copies/μL,灵敏度高特异性强。使用该检测系统对697例严重胃痛患者的胃黏膜样本进行检测,与活检和Sanger测序结果具有良好的一致性,Kappa值均超过0.90。该系统的检测结果还可用于按年龄、性别和地理位置等因素统计患者耐药模式的流行情况。这种简单快速的系统将有利于临床医生根据患者的幽门螺杆菌菌株进行个性化治疗,并避免抗生素的滥用。