目的:白血病(Leukemia)是一类造血干细胞的克隆性疾病,其克隆中的白血病细胞失去正常的成熟分化能力而停止在细胞发育的不同阶段;并在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生聚集,浸润其他组织器官,使正常造血功能受到抑制。在恶性肿瘤死亡率中,白血病居第6位(男)和第8位(女),在儿童中则居第一位。急性粒细胞性白血病是成人白血病细胞的最常见类型,应用当代的治疗方法大部分急粒可以完全缓解,但复发率较高。慢性粒细胞性白血病的死亡率在东方国家特别是中国要高于西方国家,其慢性期一般约为3-4年,应用当代的治疗方法仍有许多患者进入急性变期。因此,找到治疗白血病的有效药物和临床治疗的有效方法是一项长期艰巨的任务。中药刺五加为五加科植物(Acanthopanaxsenticos)的根和根茎,属滋补性中药。对刺五加具有调节机体免疫功能、提高机体适应性和耐受性、抗衰老等药理作用。最近由文献报道刺五加多糖(Acathopanassenticosus polysaccharides, ASPS)具有抗肿瘤作用,包括调控肿瘤细生长、促进肿瘤细胞调亡、降低肿瘤细胞侵袭能力等,其主要通过提高机体免疫力和对肿瘤细胞直接的细胞毒作用来发挥抗肿瘤作用的。但至今对其分子机制仍缺乏了解。本文主要检测不同浓度刺五加多糖对k562细胞周期及凋亡率的影响,并检测相关蛋白质,如P21,Bax及Bcl-2的变化,从而探讨刺五加多糖抑制k562细胞的有关分子机制。方法:1细胞培养:将K562细胞用RPMI-1640培养液培养,内含10%新生牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100μg/ml,置37℃,饱和湿度,5%CO2环境下培养,待细胞进入对数生长期后进行实验操作。2 MTT法检测半数抑制率(IC50):分别测定不同浓度刺五加多糖对K562细胞48小时的抑制率。取对数生长期的细胞加到96孔板,参照刺五加多糖的血浆峰浓度分组,加入无血清培养基稀释的药物,培养48小时后,加入MTT。4小时后弃去培养基加二甲基亚砜,在490nm波长下检测吸光值。根据吸光度A值计算细胞存活率(survival rate,SR),计算公式为:细胞存活率(%)=用药组A值/对照组A值×100%。根据各药物SR,由药物浓度的对数值与SR线性回归求出K562细胞的药物半数抑制浓度(IC50)。3荧光染色观察细胞核形态改变:分别收集细胞,采用不同浓度的刺五加多糖作用K562细胞48h,同时设立空白对照组。将细胞用PBS洗后重悬,加入Hochest 33258荧光试剂0.5ml,吹打混匀,滴至载玻片上,盖上盖玻片。置荧光显微镜高倍镜下计数400个细胞,观察细胞核的形态学变化。4流式细胞术检测细胞周期及凋亡:取对数生长期细胞加入采用不同浓度的刺五加多糖作用K562细胞,48h后收集细胞,70%乙醇4℃固定细胞24 h,50μg/ml PI染色30 min。流式细胞仪测定细胞周期,计算细胞周期分布及细胞增殖指数,检测凋亡率并检测凋亡相关基因Bax,Bcl-2蛋白的表达。5 RT-PCR检测p21、CyclinD1、Bcl-2、Bax、的表达:Trizol法提取细胞总RNA,采用随机引物法以M-MLV合成cDNA,以特异的引物扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳后Goldview染色,图像分析系统分析扩增条带光密度值,以β-action为内参,计算mRNA相对表达水平。结果:1半数抑制浓度测定:K562细胞IC50值为170μg/ml。2 Hochest染色观察加药后细胞凋亡时核形态变化:细胞凋亡后核固缩、染色质固缩集聚、呈块或碎裂状改变。3流式细胞仪检测结果:加药K562细胞主要表现为G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,说明加药后的K562细胞较加药前K562细胞增殖能力降低(P<0.05);凋亡相关基因Bax蛋白的表达增高,Bcl-2蛋白的表达下降。4 RT-PCR检测p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2的表达:结果可见p21、CyclinD1、Bax/Bcl-2的表达量均较加药前明显增加,CyclinD1的表达量均较加药前减少,有显著性差异(P<0.05)。结论:刺五加多糖对K562细胞抑制作用明显,主要通过上调P21及Bax/Bcl-2的表达,同时下调CyclinD1的表达,使细胞周期进程被阻滞,促进肿瘤细胞发生凋亡。本项对于了解刺五加多糖的药理作用靶点、分子机制,以及临床应用提供了参考资料。