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稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病（rice blast）是水稻上的重要病害,每年可造成10-30%的稻谷产量损失,严重威胁世界水稻种植和粮食安全。由于经济的重要性和分子遗传的可操作性,稻瘟病菌-水稻互作机制已成为研究病原菌-寄主植物互作的模式系统。对稻瘟病菌致病分子机理的深入了解不仅有利于病害防治策略的研发,而且对其它植物病原真菌致病机理的认识具有指导意义。本文通过农杆菌介导的T-DNA转化和生物信息学分析鉴定了2个稻瘟病菌致病相关基因：ZNFl和CKS1。通过基因敲除、表型分析、荧光标记、酵母双杂交等分子生物学技术分析了ZNF1和CKS1在稻瘟病菌形态发育和致病过程中的作用,主要研究结果如下：1.建立了T-DNA插入突变体库,获得了XF696等5个致病缺陷突变体为获得与稻瘟病菌致病相关新基因,本实验进行了三次ATMT转化,共获得2200个T-DNA插入突变体。其中5个突变体（XF577, XF696, XF1379, XF1521,XF1557）对寄主的致病性完全丧失。Tail-PCR以及生物信息学分析明确了5个突变体的T-DNA标记基因分别为BUF1 （MGG02252）, MGG14931, STU1 （MGG00692）, MKK2 （MGG06482）, MST12 （MGG12958）。其中 XF696 的T-DNA标记基因MGG14931的生物学功能尚未报道。2.ZNF1在稻瘟病菌附着胞发育、成熟以及侵染过程中有重要作用XF696突变体中T-DNA标记基因MGG14931编码一个假定的C2H2锌指蛋白,将该基因命名为ZNF1 （Maganporthe oryzae zinc finger protein）。 ZNF1 基因的转录产物有两种不同的剪切形式：SⅠ和SⅡ,SⅠ为主要剪切方式,并具有正常功能,而SⅡ没有功能。基因敲除、互补、表型分析及qRT-PCR等实验结果表明：1)敲除ZNF1不影响稻瘟病菌营养生长、色素沉积以及有性生殖；2)△znf1产孢能力显著增加,说明ZNF1可能负调控分生孢子的形成；3)△znf1突变体对大麦和水稻的致病性完全丧失,即使在划伤或针刺的大麦和水稻叶片表面都不能产生病斑；4)△znf1突变体芽管顶端可以分化形成膨大结构,但是不能形成正常的附着胞,也不能穿透寄主表皮；5)外源cAMP或IBMX能够诱导△znf1突变体分生孢子在亲水或疏水表面上产生囊泡状的膨大结构。但外源添加cAMP或IBMX不能完全恢复△znf1附着胞形成缺陷；6)qRT-PCR以及GFP荧光检测表明,稻瘟病菌营养生长和产孢阶段ZNFl表达水平较低,而附着胞发育与成熟阶段ZNFl表达水平显著升高。在突变体△pmkl中,ZNF1表达水平受到抑制。表明ZNF1在附着胞发育阶段表达水平受Pmk1 MAPK信号途径调控；7)NileRed和I2/KI染色表明,ZNF1参与附着胞形成过程中脂滴和糖原的移动以及降解；8)H1-RFP标记显示△znf1附着胞形成过程中,芽管尖端能进行多次有丝分裂,但细胞核不被降解,细胞自噬性降解过程受阻；9)结构域缺失和点突变实验显示3个C2H2锌指结构以及核定位信号序列（NLS）对Znfl蛋白功能起重要作用。3. CES1编码细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的亚基（Cyclin-dependent kinase subunit）,参与稻瘟病菌营养生长、产孢、致病性等重要过程在先前的研究中,本实验室鉴定了一个新的稻瘟病菌转录调控因子Soml。研究表明Soml作用于稻瘟病菌cAMP-PKA信号途径下游,在稻瘟病菌形态分化和致病性中起关键作用。本研究根据△soml的SAGE （serial analysis of gene expression）表达谱测序数据并结合生物信息学分析,选取了8个可能与Soml相关的基因进行了敲除,其中△cksl表型明显与野生型菌株不同。本实验进一步对CKS1的生物学功能进行了分析,结果如下：1)酵母双杂交实验证明稻瘟病菌中Cksl与Soml之间存在互作；2)△cksl突变体营养生长缓慢,菌落发白,气生菌丝蓬松,不能产生分生孢子；3)qRT-PCR分析显示,色素合成基因ALB1、RSYl和BUFl,以及产孢相关基因COS1、CON7、ACRl1、HTF1（HOX2）在△cks1中显著下调；4)△cksl能在菌丝尖端产生附着胞结构,但附着胞功能丧失,不能穿透寄主表皮,也不能在寄主组织内进行侵染生长；5)△cks1突变体几乎完全丧失对大麦和水稻的致病性；6)△cksl菌落疏水性下降,菌落呈现自溶现象；7)△cks1突变体对细胞壁压力胁迫抗性增加,几丁质合成酶编码基因的转录水平在△cks1中明显上调,表明CKS1参与维持稻瘟病菌细胞壁完整性；8)小麦赤霉病菌的FgCKS1能恢复稻瘟病菌△cks1的表型缺陷,表明在丝状病原真菌中Cks1结构和功能都非常保守；9)Cksl-GFP融合蛋白亚细胞定位分析表明,Cks1在营养生长阶段主要定位于细胞质中,而分生孢子形成阶段,细胞质和细胞核中都有明显的分布；10)结构域缺失实验表明Cks1蛋白中Ubiquitin-binding domain, Cdc28-binding domain 以及 Anion-binding site对Cks1蛋白发挥正常功能有重要作用；11)酵母双杂交表明,稻瘟病菌中Cks1与细胞周期蛋白依赖性激酶Cdc28存在互作,Cdc28-GFP融合蛋白定位显示Cdc28与Cks1有相似的胞内定位模式。