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猪链球菌病是一种重要的人畜共患病,猪发病后临床症状以脑膜炎、败血症和关节炎为主要特征。该病在世界范围内流行,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。猪链球菌分为29种血清型,根据其菌株不同毒力,它们可以分为高致病性,低致病性和无致病性菌株。通常情况下,猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2,SS2）被认为是毒力最强的血清型,在临床发病猪中分离率最高。近年来,猪链球菌9型（Streptococcus suisserotype9,SS9）在中国、澳大利亚、比利时、荷兰和德国等国家猪场分离比率逐渐升高,现已成为猪链球菌的优势血清型之一。目前对于该菌的检测只是依赖于临床的分离培养以及分子生物学鉴定,而这些检测手段都比较费时费力,不适用于大规模的流行病学调查。另外,国内多家研究单位在研制猪链球菌9型的灭活疫苗,该疫苗的免疫水平评价也需要对SS9的抗体进行检测。荚膜多糖（capsular polysaccharide,CPS）是猪链球菌9型的主要毒力因子之一,具有型特异的抗原性,也是重要的保护性抗原,可用于SS9引起的猪链球菌病的诊断及亚单位疫苗的制备。本研究通过提取猪链球菌9型荚膜多糖,作为抗原,建立猪链球菌9型抗体间接ELISA检测方法,用于猪链球菌9型的血清流行病学调查,为猪链球菌病的有效防控提供新的手段。1.猪链球菌9型荚膜多糖的提取纯化本研究采用乙醇沉淀法得到CPS粗提物,经过苯酚抽提及透析后得到纯化的猪链球菌9型荚膜多糖。苯酚-硫酸法测定纯化后的多糖浓度为65.5 μg/mL,经紫外分光光度计进行全波长扫描后在200 nm处得到单一的最大吸收峰,而在260、280 nm处无吸收峰,说明成功提取到纯度较高的荚膜多糖。纯化后的CPS经过琼脂双扩散试验鉴定,其能与SS9阳性血清结合,具有良好的免疫原性,可以作为间接ELISA检测用的包被抗原。2.猪链球菌9型抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用以纯化的CPS包被ELISA板,建立了猪链球菌9型抗体间接ELISA检测方法。优化的反应体系如下:CPS包被抗原的最佳包被浓度为0.2μg/mL,包被条件为37℃2 h;最佳封闭液为含5%脱脂乳的PBST溶液;待检SS9抗血清最佳稀释倍数为100倍,37℃反应45min;HRP标记的山羊抗猪IgG二抗最佳稀释倍数为5000倍,37℃反应60 min;TMB底物在37℃避光显色15 min。用该方法测定33份SS9阴性血清的OD450,根据统计学原理,对这33份样品OD450的平均值X和标准方差SD进行统计处理,确定该方法的阴阳性临界值为X+3SD=0.341。用建立的方法检测4份SS9阳性血清,当血清以1:800稀释时检测结果仍然为阳性,说明所建立的检测方法具有较强的敏感性。用该方法检测胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、猪链球菌2型、马链球菌兽疫亚种等病原菌的阳性血清均为阴性;且该方法的批内重复性试验变异系数在4.25%-8.72%之间,批间重复性试验变异系数在4.05%-9.47%之间,说明该方法具有良好的特异性和重复性。用该方法对来自五个不同猪场随机采集的410份血清样本进行检测,检测到抗体阳性的血清159份,抗体阳性率达38.8%。为了验证该方法的有效性,该方法检测了本实验室研制的经过猪链球菌9型灭活疫苗免疫后的仔猪血清,结果发现免疫后的血清抗体水平显著升高,而未免疫仔猪血清抗体未出现显著变化,这说明该方法具有较高的可靠性。本文完成了对猪链球菌9型荚膜多糖（CPS）的提取与纯化,以及利用提取的荚膜多糖作为抗原,成功建立了猪链球菌9型抗体间接ELISA检测方法。并依据该方法检测了收集的临床血清样本,证实该方法具有较好的敏感性、特异性、重复性,可以用于临床猪链球菌9型抗体的检测,具有一定的临床应用价值。该检测方法通过进一步的优化和标准化,可以为猪链球菌9型引起的猪链球菌病提供新的诊断方法。