丙型肝炎病毒的检测及基因分型新方法

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丙型肝炎病毒(HCV)在全世界约有1.7亿感染者,由于其疫苗难以研制且尚无特效药,因此,对丙型肝炎的早期诊断是非常有意义的。现阶段对丙肝的常规诊断方法为PCR与ELISA,二者虽属于成熟的检测方式,但均较为耗时,操作繁琐,HCV的检测急需简便且灵敏的方法。本文利用分子信标与金纳米颗粒针对HCV病毒RNA做了一系列检测及基因分型的实验。首先是使用Duplex-specific nuclease(DSN)作为分子信标的信号放大工具,针对HCV RNA做了直接检测。同时,还有利用该探针对HCV RNA的PCR产物进行检测达到基因分型目的的实验。另外,应用金纳米颗粒,我们对HCVRNA做了灵敏而简易的检测。(1)通过DSN对MB与RNA的杂交产物进行酶切,可实现RNA的重复利用,杂交信号得到了放大。DSN能将MB的检测灵敏度提高2000倍以上。对于JFH1RNA标准样品,我们在较低的浓度下将其检测了出来。然后,实验检测了huh7.5阳性细胞的RNA。对于血清RNA样品,此体系也能区分其阴性与阳性,且信号强弱与ELISA结果一致。(2)利用MB对PCR产物进行检测,即可知道模板除开引物外,其他位置的序列。本文找到了适当的MB检测双链DNA(dsDNA)即PCR产物的方法和条件,以HCV的两种亚型,JFH1与H77S病毒基因相差较大的部分为靶点设计探针,将二者区分开来。分子信标同双链DNA分子中与之互补的一条进行杂交,可在对病毒RNA PCR反应过后,较为简便地对其基因亚型进行确认。(3)在盐溶液中,金纳米颗粒需要大量吸附单链DNA(ssDNA)在其表面才能保持胶体状态。当体系内有ssDNA的互补RNA与其杂交时,则金颗粒会发生团聚。利用ssDNA、金纳米颗粒、盐溶液三者,便可在有无HCV RNA存在时分别观察到金纳米颗粒的变色(聚沉)以及不变色的现象,另外,将反应后的溶液在紫外-可见分光光度计中检测金纳米颗粒特有吸收峰的峰值,可更精确更灵敏地实现对HCV RNA的检测。这些检测方法还不够完善,但具有简便、快捷、灵敏且特异性好的特点,为检测HCV病毒提供了新的思路。
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