大量临床和基础研究证实，氧化苦参碱（OM）具有良好的抗乙型肝炎病毒效果，有着很好的临床应用前景。然而目前的研究尚不够系统深入，不能完全阐明其抗病毒机理。此外，如何评价某种药物抗病毒效果，病人在抗病毒治疗后反应性如何，除肝组织病理检查外，HBV DNA定量检测无疑是判断抗病毒药物治疗效果中最直接、最可靠和最有价值的指标。 目的：建立等效竞争PCR联合PCR产物酶联杂交定量检测HBVDNA技术（PCR-ELISA法），并将之应用于氧化苦参碱的体内外抗病毒作用机理的研究中，以进一步探讨氧化苦参碱对乙型肝炎的治疗作用。 方法：1．建立等效竞争PCR联合PCR产物酶联杂交定量检测HBVDNA技术（PCR-ELISA法）。采用突变引物法，以野生HBV为模板，经一步PCR扩增出突变片段，并克隆入pTadv质粒，制备成完全等效的竞争PCR内参照。通过竞争PCR将内参照与野生HBV一同扩增，应用微反应板酶联杂交技术对PCR产物作定量分析。2．以转染HBV基因的HepG2.2.15细胞株为研究对象，无环鸟苷作为阳性对照，观察氧化苦参碱不同浓度、不同作用时间对细胞培养上清中HBV DNA水平的影响。计算氧化苦参碱对细胞分泌HBV DNA的抑制率，以综一合评价氧化苦棚的体外抗IIBV龈，并进一步探讨其抗乙肝病毒机理。 靴：1．我们建立的等效竞争PCR联合PCR产物酶联杂交定量检测HBV DNA技术（PCRELISA法）具有以下优点：第一，制备方法的优势：在目的片段上龈理想的扩增区域，并设计合适的突变引物，将突变引物与另一根配对引物及目的基因一起作一轮PCR即可获得突变片段，与目前所有报道方法相比，这种方法最简单、方便、易行。第H，完全等效扩增：突变片段的长度和A、T、C、G组成均与野生片段完铡凤 因此可以保证两种模板在PCR过程中等效扩增，提高了定量狐的精确度。第三，为竞争PCR产物的杂交检测饿了最佳条件：突变片段的突变序列，是突变片段特异的；杂交位点，而且这个杂交位点的所有杂交驰均与拟扩增的目的片段的相对应部棚同，因此可在此剜墒立竞争PCR产物的酶联杂交定量分析方法。与人工化学合成等长DNA内参照相比，在应用原理方面有相同的特点，即既能保证与野生片段等效扩增，又可在杂交检测溅中与野生片段区分，但在制备方法上则比之更简单、易行和经济。第四，特异性强，灵鹏高（可达 10fg加l），稳定性佳。2．栅究观察了不同浓度氧化苦翱对 HepGZ．2．15细胞表达 HBy DNA的抑制效果，结果表明，随着浓度升高，OM抑制HepGZ．2．15细胞分泌IIBV DNA的作用逐鹏强。当OM为1000pg／ml时，其抑制率最高，达79．6巩但是，再提高删浓度，可能由于药物毒性作用，细胞死亡增加，导致大量的病毒由死亡的细胞中释出，影响检测结果。我们的研究瞰现，保持药物在培养上清中的浓度是保证药物抑制率的关键。相同浓度的药物在作用第一个24／J’时、第二个24小时、第三个24小时，它的抑制率相似。但若延长作用时间，即连续培养 48或 72小时，药物抑制细胞分泌 HBV DNA ．。＿．＿，、w－m－－－－x＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊、、，、——．＿—＿＿．＿、．、，。，，。，＿—＿——＿．＿＿ 中文摘要能力明显眺．由于细胞的自然新陈代谢，细胞死亡后，病毒从细胞内释放。我们的实验结果尚不能揭示删连续作用与 HePGZ．2．15细胞分泌删加A之问的关系：删作用第九天，所测得H矾mA量几与空白对照相同。 蛐：1．我们建立的等效竞争PCR联合PCR产物酶联杂交定跳测HBy DNA技术（KWISA法）敏感、稳定、特异性好，并且能最大地满足竞争PCR的等效性。有极好临床应用前景。z氧化苦纲能在HBV复制水平抑制病毒的合成，但其究竟作用于病毒复制雌的哪一环节，或是否对病毒转录、翻译及分泌能力亦具有干扰作用，有待进一步研究证实。