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免疫应激下，动物食欲下降、蛋白质周转加速、糖类利用率剧增、脂肪代谢紊乱，最终导致动物生长发育受缓以及生产性能下降，而持续的免疫应激还增加动物死亡率。TLR信号通路的过度激活是引起畜禽免疫应激的主要原因之一。为了保证TLR介导正确的免疫应答，机体存在多种精密的TLR调控机制，及时抑制TLR信号，维持机体的免疫平衡。其中，miRNA对免疫调控起着重要作用，能够通过负调控TLR信号通路从而抑制TLR信号的过度激活，缓解免疫应激。因此，本文旨在研究miRNA对TLR信号通路的负反馈调控作用和机制，不仅有助于进一步揭示机体复杂的免疫调控机制，还有助于筛选潜在的药物或营养素作用靶标。进一步研究营养素1，25-(OH)2-D3通过调控miRNA表达和TLR信号通路，进而缓解免疫应激，降低动物死亡率，提高动物生产性能，降低饲养成本，并为最终寻求缓解免仔猪疫应激的有效措施提供新的思路。本文主要研究内容如下: 试验一:NF-κB依赖性miRNAs的筛选与验证 为筛选受到激活的TLR信号通路诱导的miRNA，本试验首先利用芯片技术筛选出受到LPS诱导的miRNAs，针对ssc-miR-628差异性表达程度最高对其进行深入研究。RT-PCR结果显示，ssc-miR-628受到LPS诱导后其表达呈时间依赖性，即从应答早期（第3h）开始快速高效表达，到第9h达到峰值，随后12-15 h呈稳定下降，进一步验证了芯片结果。另外，NF-kB抑制剂姜黄素对ssc-miR-628表达的抑制作用也呈时间依赖性，这说明NF-kB可能参与对ssc-miR-628表达的调控。利用生物信息学分析，预测SSC-MIR-628基因上游3 kb处一个可能的NF-κB结合位点，突变其关键位点。通过DNA凝胶迁移阻滞试验发现，NF-κB可通过作用于SSC-MIR-628基因上游启动子区从而调控其表达，验证了ssc-miR-628的NF-κB依赖性。 试验二:ssc-miR-628对TLR信号途径关键转接分子MyD88表达的调控效应及机制 为探索ssc-miR-628对TLR信号通路的调控作用，本试验首先通过生物信息学分析预测ssc-miR-628可能靶向作用于MyD88，并找到MyD883UTR上的作用位点。将大小为1221 bp、含作用位点的MyD883UTR克隆至pMIR-Luciferase质粒中，重组质粒MyD88-3UTR-Luciferase与ssc-miR-628 mimic共转染293T细胞24h，以MyD88-3UTR-Luciferase单独转染为对照组。结果显示，共转染组的荧光素酶活力显著降低，说明ssc-miR-628可直接靶向作用于MyD883UTR从而抑制其表达。 在证实MyD88是ssc-miR-628的靶标后，又通过mimic转染LPS诱导的PBMCs。对MyD88依赖型信号通路中各关键转接分子以及NF-κB的mRNA水平检测结果显示，LPS组中各检测分子基因表达水平均显著提高，而LPS+mimic组中均显著降低，说明激活的TLR信号通路中过表达ssc-miR-628抑制各关键转接分子以及NF-κB的mRNA水平。Western blot结果显示，LPS组中MyD88和NF-κB蛋白水平均显著提高，而LPS+mimic组中均显著降低，说明激活的TLR信号通路中过表达ssc-miR-628可抑制MyD88和NF-κB蛋白水平。 综上所述，ssc-miR-628通过直接靶向作用于MyD883UTR，抑制MyD88 mRNA水平，进而负反馈调控激活的TLR信号通路。 试验三:1，25-(OH)2-D3对ssc-miR-628表达及TLR信号通路的调控 为探索营养素1，25-(OH)2-D3对ssc-miR-628表达和TLR信号通路的调控作用，本试验在受到LPS诱导的PBMCs中添加10-7 mol/L、10-8 mol/L和10-9 mol/L三种浓度的1，25-(OH)2-D3，处理12 h。结果显示LPS诱导PBMCs后细胞因子浓度和ssc-miR-628表达均显著升高。而在添加不同浓度1，25-(OH)2-D3后，发现较低浓度抑制ssc-miR-628表达，促进细胞因子分泌;较高浓度促进ssc-miR-628表达，抑制细胞因子分泌。说明1，25-(OH)2-D3对ssc-miR-628表达和TLR信号通路具有双向调控作用。 综上所述，TLR信号通路激活后，通过活化的NF-κB作用于SSC-MIR-628基因上游启动子区进而调控ssc-miR-628的表达，使其表达呈时间依赖性。反过来，过表达的ssc-miR-628通过直接靶向抑制MyD88活力，进而负反馈调控激活的TLR信号通路。在上述研究基础上，我们筛选营养素1，25-(OH)2-D3，发现其对激活的TLR信号具有双向调控作用，即高浓度1，25-(OH)2-D3促进ssc-miR-628表达，抑制TLR信号;而低浓度抑制ssc-miR-628表达，促进TLR信号。