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舌鳞状细胞癌(Tongue squamous cell carcinoma，TSCC;简称舌鳞癌)在头口腔颌面一头颈肿瘤中发病率最高，约占43.4％。舌癌的治疗手段主要为手术、放疗、化疗和生物治疗等。早期舌鳞癌的效果较好，晚期病例或复发、转移的病例疗效差。总的五年存活率为50％-60％。化疗是舌鳞癌治疗的主要手段之一，有效的诱导化疗和/或术后辅助化疗能提高舌鳞癌的局部控制率和患者的术后生存质量，然而舌鳞癌化疗耐药性问题受到越来越多的关注。有证据表明，肿瘤细胞的上皮-间充质转变(Epithelial mesenchymal transition，EMT)与肿瘤化疗耐药紧密相关。
本课题检测舌鳞癌细胞株、舌鳞癌及癌旁组织中Jagged1、TGF-β1和Smad3基因及蛋白的表达与舌鳞癌的发生、发展以及侵袭、转移之间的关系，阐明TGF-β1-Smad3-Jagged1信号通路调控EMT的机制;在此基础上，抑制或阻断TGF-β1-Smad3-Jagged1信号通路，从而抑制肿瘤细胞发生EMT，旨在探讨以TGF-β1-Smad3-Jagged1信号通路为靶点治疗舌鳞癌新的治疗模式。
第一章 TGF-β1-Smad3-Jagged1信号通路途径分子在舌鳞状细胞癌中的表达及意义
一、方法
1.通过RT-PCR、免疫组化和Western Blot分别检测取自89例舌癌患者的组织标本(舌癌及癌旁组织)中Notch1、Smad3、Jagged1的mRNA与蛋白表达水平，并分析其表达与患者临床病理特征的关系。
2.采用RT-PCR、免疫组化和Western Blot检测人舌癌Tca8113、Cal-27细胞株中Notch1、Smad3和Jagged1蛋白和mRNA表达水平，并分析其与舌鳞癌细胞增殖的相互关系。
二、结果
1.舌鳞癌、癌旁组织以及细胞株中均检测到Notch1、Smad3、Jagged1 mRNA的表达，其在舌癌组织中的表达量较癌旁组织高(P＜0.05)。
2.舌鳞癌及癌旁组织以及细胞株中均检测到Notch1、Smad3和Jagged1蛋白的表达。Notch1在癌旁舌粘膜组织的表达率为高于癌旁组织(x2=7.30，P＜0.01)。Smad3在癌旁组织的表达率明显高于癌旁组织(x2=5.84，P＜0.05)。Jagged1在癌旁和癌组织中的表达率无差异性(x2=2.42，P＞0.05)。
3.Notch1和Smad3的表达和临床分期有相关性(x2=18.81，P＜0.01;x2=22.29，P＜0.01)，而Jagged1无相关性(x2=0.53，P＞0.05)。
4.Notch1、Smad3、Jagged1与病理分级以及性别无相关性。
5.Notch1在有淋巴结转移的病例的表达率明显高于无淋巴结转移的病例(x2=7.30，P＜0.01)。Jagged1在有淋巴结转移的病例中表达分级高(x2=10.82，P＜0.01)。
三、结论
TGF-β1-Smad3-Jagged信号通路基因和蛋白在舌鳞癌细胞系、舌鳞癌组织以及癌旁组织均有表达，但表达情况不同，提示TGF-β1-Smad3-Jagged1信号通路在舌鳞癌细胞的分化和增殖中具有重要作用。TGF-β1-Smad3-Jagged信号通路的失调可能是舌鳞癌发生的一个重要机制。
第二章Jagged1RNAi慢病毒载体的构建及其抑制TGF-β1-Smad3-Jagged1信号通路诱导舌鳞癌Tca8113细胞EMT的研究
第一节Jagged1RNAi慢病毒载体的构建
方法:
1.JaggedlsiRNA表达质粒的构建:利用GenBank检索人Jagged1信息，根据信息，按照设计原则，设计Jagged1靶点。经BLAST比对检测同源性之后，合成双链的 DNAoligo。线性化的 RNA干扰载体质粒pAJ-U6-shRNA-CMV-eGFP/PuroR，双酶切，转化大肠杆菌感受态细胞，选择阳性克隆进行鉴定。
2.Jagged1 RNA干扰靶点的验证:293T细胞感染JaggedlRNA干扰的表达载体质粒pAJ-U6-shRNA-CMV-eGFP/PuroR。采用荧光镜检观察绿色荧光蛋白的表情况，准备下一步实验;
3.慢病毒包装与纯化:三质粒系统共转染293T细胞，包装慢病毒载体，并应用氯化铯纯化;
4.慢病毒滴度测定及保存:流式细胞仪测定病毒滴度。
结果:
1.经BLAST检索，所设计的JaggedlsiRNA序列，与Jagged1完全同源，非常特异。
2.成功构建靶向 Jagged1 RNAi载体质粒: pAJ-U6-Jagged1shRNA-CMV-eGFP/PuroR。
3.PCR鉴定和基因测序结果证明，获得了预想的Jagged1shRNA载体质粒，能够感染293T细胞。
4.制备慢病毒载体、测定病毒滴度和Tca8113、Cal-27细胞的转染效率;干扰组病毒滴度为:1.63E+09 TU/ml，NC的病毒滴度为:3.35E+09 TU/ml。
5.慢病毒感染Tca8113及Cal-27细胞效率。本实验确定转染的感染条件为Tca8113 MOI=40和Cal-27 MOI=20和40。
6.Tca8113和Cal-27细胞的KD组可见到密集的绿色荧光细胞，提示携带GFP的慢病毒载体系统可有效的感染Tca8113和Cal-27细胞，绿色荧光蛋白GFP得到充分表达，证明JaggedlshRNA表达框架转入了Tca8113及Cal-27细胞。
结论:
1.获得Jagged1的siRNA序列，命中靶序列，与Jagged1完全同源;
2.成功构建了 Jagged1 RNAi载体质粒: pAJ-U6-Jagged1shRNA-CMV-eGFP/PuroR;经测序实验显示:所合成的Jagged1干扰序列与所设计的序列是相一致的。
3、制备了Jagged1RNA干扰的慢病毒载体敲减组及阴性对照组，病毒的滴度是1.63×109及3.35×109TU/ml。该载体可成功感染Tca8113、Cal-27细胞，最适合的条件分别是Tca8113，感染复数MOI=40以及Cal-27，感染复数MOI=20和40。
第二节Jagged1RNAi慢病毒载体抑制TGF-β1-Smad3-Jagged1信号通路诱导舌鳞癌Tca8113细胞EMT的研究
方法:
(一)体外研究
1.Real time RT-PCR检测RNA干扰对Tca8113细胞Jagged1mRNA表达水平的敲减效果;
2.Western Blot检测Jagged1RNA干扰对Tca8113细胞Jagged1蛋白表达水平的敲减效果;
3.Western Blot检测干扰前后细胞系中EMT相关分子E-cadherin、Vimentin和Snai12的表达情况;
4.Tca8113细胞应用MTT法绘制生长曲线;
5.划痕实验检测Tca8113细胞迁移水平;
6.Tranwell检测RNA干扰后Tca8113侵袭率变化。
(二)体内研究裸鼠成瘤实验(CON、NC、RNAi组各5只)
1.各组Tca8113舌鳞癌细胞接种到裸鼠腋下;
2.观察比较转染靶向Jagged1慢病毒载体RNAi系统后舌鳞癌细胞的成瘤能力(肿瘤体积大小及生长速度);
3.Western blot检测裸鼠取下的肿瘤标本Jagged1以及EMT相关分子E-cadherin、Vimentin和Snail2蛋白的表达。
结果:
1.Real time RT-PCR结果显示:Tca8113细胞NC组与CON组Jagged1的表达比较无统计学意义(P＞0.05);KD靶点在Tca8113细胞中对Jagged1基因的表达有显著敲减效果(P＜0.05)。在Tca8113细胞，MOI=40时KD组对Jagged1基因敲减效率约为56.47％。
2.Western Blot结果表明Tca8113细胞，在MOI=40时，KD组较NC组Jagged1蛋白表达降低了77.11％(P＜0.05)。NC组与CON组Jagged1蛋白表达水平的差异无统计学意义(P＞0.05)。
3.Western Blot检测到Tca8113细胞，在MOI=40时，KD组较NC组Vimentin和Snai12蛋白表达分别下调了63.3％(P＜0.05)和71.6％(P＜0.05)，而E-cadherin表达相对于NC组上调了79％(P＜0.05)。细胞的CON组与NC组E-cadherin、Vimentin和Snail2蛋白表达水平的差异无显著性(P＞0.05)。
4.细胞划痕实验结果发现，KD组的划痕愈合能力较NC组减弱。可见干扰Jagged1后，对细胞迁移能力有明显的抑制作用。
5.MTT比色法检测细胞存活和生长:Tca8113细胞生KD组长抑制率在72小时为29.36％(P＜0.05)。
6.Transwell结果:Jagged1 RNAi慢病毒载体感染Tca8113后，KD组的侵袭能力明显下降(P＜0.05)。
7.裸鼠成瘤实验提示KD组较NC或CON组Tca8113细胞成瘤能力明显降低，Western Blot检测发现KD组Jagged1蛋白的表达下降。RD组较NC组Vimentin和Snail2蛋白表达分别下调了59.2％(P＜0.05)和53.1％(P＜0.05)，而E-cadherin表达相对于NC组上调了47.6％(P＜0.05)。
结论:
1.下调Jagged1基因的表达，可使TGF-β1诱导发生EMT的Tca8113舌鳞癌细胞生长水平明显受到抑制，侵袭能力明显下降，成瘤能力下降。
2.在其EMT过程中，E-cadherin的下调和Vimentin和Snail2上调得到了抑制，从而EMT现象得到抑制。
3.初步证实TGF-Smad3-Jagged1-Notch1-Snail2-E-cadherin信号通路途径活化与舌鳞癌的发生、发展以及EMT和转移有重要关系，可为舌鳞癌的治疗提供新的靶点。