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随着生物技术和临床治疗的发展,对高纯度、高活性IgG的需求日益增长,极大的促进了其纯化工艺的发展。尽管传统的沉淀法和离心过滤法已经在IgG纯化过程中大量使用,但其分离纯度较低,生物活性不高,限制了其在许多领域广泛利用。而色谱技术仅适合于分析检测和小规模的分离,因此,发展新的非色谱技术,显得非常重要。本文采用微悬浮聚合技术以醋酸乙烯酯和二乙烯基苯制备微米级的PVAc-DVB-Fe3O4磁性聚合物微球,通过偶联恰当的特征配合基,实现磁性聚合物微球对人体免疫球蛋白G(IgG)的特异性分离。利用磁分离技术,直接从人血清中分离、纯化人体免疫球蛋白G。在分离过程中,主要讨论了血清与磁性微球的比例、吸附溶液和解吸附溶液的pH值、解吸附溶液的离子强度变化、吸附和解吸附的时间变化、吸附的温度等因素对分离的影响,进一步探讨了特异性吸附的作用方式,并通过高效液相排阻色谱法(HPSEC)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定蛋白法等分别进行了定性和定量分析,证明了此方法的可行性与可靠性。主要研究结果如下:
⑴用化学共沉淀法制备了超顺磁性、表面亲油性的Fe3O4纳米磁流体;通过微悬浮聚合法实现Vac和DVB单体对磁粒子的有效包裹,制备了平均粒径为5.68mm的分散均匀的磁性聚合物微球,主要粒径分布在1-10.5μm之间,其磁含量为25%,饱和磁强度达到17.1emu/g,且无剩磁。
⑵磁性聚合物微球表面有酯官能团(-OOC2H5),通过水解反应在其表面生成丰富的羟基,通过Michael加成反应,在其表面用二乙烯基砜活化,再在其表面修饰配基(5-甲基-2-巯基-1,3,4-噻二唑和2-巯基苯并咪唑-5-磺酸钠二水合物),制备嗜硫性磁性聚合物微球,实现嗜硫磁性聚合物微球对人体免疫球蛋白G(IgG)的特异性分离。
⑶研究了5-甲基-2-巯基-1,3,4-噻二唑配基修饰的嗜硫磁球分离血清的各种影响因素,结果表明较佳的分离条件为:吸附缓冲液的pH值为6.0;血清量是0.7mL/g;吸附温度宜在室温(厦门,三月份,25℃左右)下;吸附时间选择30min;解吸附溶液为1.0 mol/LNaCl溶液。
⑷研究了2-巯基苯并咪唑-5-磺酸钠二水合物配基修饰的嗜硫磁球分离血清的各种影响因素,结果表明较佳的分离条件是:吸附缓冲液的pH值为6.0;血清量是0.5mL/g;吸附温度宜在室温(厦门,三月份,25℃左右)下;吸附时间选择40min;解吸附溶液为0.2 mol/L(NH4)2SO4溶液。
⑸这种磁性聚合物微球从血清中分离抗体,表现出强烈的特异性,分离出抗体的生物活性高、纯度极高,且工艺条件简单,分离条件温和,分离周期短,分离效率高,是一种高纯度、高活性、快速,简单的抗体纯化技术,因此,在规模化分离抗体方面表现出较大的潜力。