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目的:糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是高血糖诱导肾脏微血管损伤并逐渐累及肾功能的肾脏严重并发症,其病程进展与患者血糖水平密切相关。高糖可以诱导肾脏固有细胞发生自噬、凋亡和坏死。2005年Degterev等首次报道并命名了一种新型由TNF-α诱导的受体作用蛋白(receptor integrated protein,RIP)调控的非caspase依赖性细胞死亡模式,它同时兼具坏死和凋亡的双重特性,被命名“necroptosis”。近年来,对necroptosis的研究主要集中在necroptosis的分子机制和与necroptosis密切相关的肿瘤靶向治疗方面,但在DKD中necroptosis是否表达及其作用如何还不清楚。本研究中,我们以链脲佐菌素STZ诱导的糖尿病小鼠模型为研究对象,首先观察糖尿病状态下,肾组织是否存在necroptosis,然后采用腹腔注射necroptosis特异性抑制剂necrostatins-1(Nec-1),检测necroptosis在糖尿病小鼠的肾组织尤其是肾近端小管细胞的炎症及持续加重的间质纤维化中的作用,可以揭示DKD损伤的新机制并为DKD的防治提供新的思路和药物治疗新靶点。方法:6-8周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠按照随机区间法分为正常对照组(N)、单纯糖尿病组(DM)、正常对照+Nec-1干预组(N+Nec-1)、糖尿病+Nec-1干预组(DM+Nec-1)。采用多次小剂量链脲佐菌素STZ(50 mg/kg,溶于0.1mol/LpH值4.5的枸橼酸盐缓冲液中)腹腔注射诱导建立小鼠Ⅰ型糖尿病模型。对照组小鼠腹腔注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液,实验期间两周检测一次小鼠的血糖及体重情况。Nec-1药物干预的小鼠于糖尿病成模当天腹腔注射1mg/kg/day的Nec-1,实验期间动物自由进食、饮水,不使用胰岛素及其他降糖药物。于STZ注射后24周,收集小鼠24h尿和血清,用于测定尿蛋白含量、血糖、尿素氮和血肌酐。收集各组小鼠肾组织,冠状切面剖开,迅速将一半的肾组织标本放于标记好的小盒内,用4%的多聚甲醛固定液进行固定,检测肾组织形态学及免疫组化观察RIP1、RIP3、IL-1β和Col I的蛋白表达,剩余肾组织经液氮速冻,用于提取肾皮质总蛋白和总RNA。Western blot检测RIP1、RIP3、TNF-α、IL-1β、TGF-β1和Col I的蛋白表达情况;实时荧光定量PCR检测TNF-α、IL-1β、TGF-β1和Col I的mRNA的表达情况。结果:1.小鼠的一般状况及血尿生化指标与对照组小鼠相比,糖尿病组小鼠多饮、多食、多尿并逐渐消瘦,其血糖水平、肾重及肾重/体重比明显升高,BUN、Scr及UAE的含量亦显著升高;Nec-1干预抑制了肾脏肥大,降低了糖尿病小鼠的肾重/体重比,下调了BUN、Scr及UAE的含量。2.小鼠肾脏形态学改变光镜下观察,糖尿病状态下的小鼠其肾小球略增大,但毛细血管腔略显狭窄,肾小球内系膜细胞增生并伴系膜基质沉积,局部肾小管上皮细胞出现明显的空泡变性,小管管腔显著扩张;肾间质可见单核细胞及淋巴细胞浸润。与糖尿病小鼠相比,Nec-1干预后肾小球及肾小管的病变减轻,扩张的肾小管管腔回缩;肾小管上皮细胞的损伤也显著降低,肾间质炎细胞浸润也显著减少。肾间质胶原纤维沉积减少,纤维化程度减轻。3.免疫组化检测肾组织RIP1、RIP3、IL-1β和Col I的蛋白表达与对照组小鼠相比,RIP1、RIP3、IL-1β和Col I在糖尿病组小鼠肾组织内的表达显著升高;Nec-1干预显著降低了RIP1、RIP3、IL-1β和Col I的高表达,有显著性差异。4.Western Blot检测肾皮质RIP1、RIP3、TNF-α、IL-1β、TGF-β1和Col I的蛋白表达和正常小鼠比较,RIP1、RIP3、TNF-α、IL-1β、TGF-β1和Col I在糖尿病小鼠肾组织的蛋白表达均明显增高;与糖尿病组小鼠相比较,Nec-1干预后各蛋白表达量均出现显著的下调。5.Real-time PCR检测肾皮质TNF-α、IL-1β、TGF-β1和Col I的mRNA表达与对照组小鼠相比,糖尿病组小鼠肾组织TNF-α、IL-1β、TGF-β1和Col I的mRNA的表达明显增加;与糖尿病组小鼠相比较,Nec-1干预后mRNA的表达量均显著下调。结论:1.Necroptosis参与了糖尿病肾组织的损伤过程,necroptosis特异性阻断剂Nec-1对糖尿病肾小管细胞具有保护作用。2.Necroptosis特异性阻断剂Nec-1通过抑制肾小管细胞的炎症和延缓肾间质的纤维化进展,发挥了对糖尿病状态下的肾脏的保护作用。