目的:　　 洋橄榄素是1959年从生孢链霉菌中首次分离得到的。它具有免疫抑制、抗革兰阳性菌、抗线虫、抗原生动物、和抗肿瘤细胞等多种生物学活性，与化学药剂相比，安全性高，治疗效果好，易降解，对环境污染小，并且现已进入临床应用。　　 近年来，免疫抑制剂生物合成基因簇的研究引起了国内外的广泛关注。链霉菌基因工程技术的发展，使得克隆次级代谢产物生物合成基因、有目的地进行基因重组和基因定向改造、提高菌种的生产能力、产生新的代谢产物成为可能。　　 而吸水链霉菌具有广泛的生物学活性，其代谢产物在临床中具有重要的应用价值。基因工程技术在大环内酯类抗生素研究中的应用，已经成为现代医学研究的热点。通过基因工程的方法改造微生物代谢产物的化学结构与组成，对解决当前日益严重的致病菌耐药性问题带来了新的希望。　　 由于一种微生物同时产生几种不同的抗生素，给工业发酵生产带来了较大的困难。选育单组分活性物质的产生菌，可以从遗传上选择性地只生产一种特定的生物活性物质，而不再产生其他的活性成分，这样的菌种具有产物单一，生产过程简单，易于提取纯化以及降低生产成本等许多优点。　　 本研究采用分子生物学的方法使产生两种主要抗生素—雷帕霉素和洋橄榄素的吸水链霉菌通过失活雷帕霉素生物合成基因簇中的rapA基因，阻断该产物的生物合成，从而获得主要产洋橄榄素的基因工程菌，提高洋橄榄素的产量。此外，本研究对获得的基因工程菌株进行自然分离，以得到遗传性能稳定的高产菌株。　　 方法:　　 一、质粒pG07的构建　　 以吸水链霉菌ATCC29253的染色体为模板，通过PCR扩增rapA基因片段，将PCR产物进行胶回收后分别与pMD18-T质粒进行连接，转化后得到阳性克隆，然后将得到的阳性克隆扩增培养后提质粒，并将得到的重组质粒用酶切来验证插入方向，选择正确插入方向的质粒分别命名为pG01和pG04。然后再次将质粒pG01和pG04酶切，选择目的片段进行胶回收再与pKC1139酶切后的片段16℃连接过夜，转化E.coli DH-5α感受态。通过抗性筛选得到阳性克隆，扩增培养细菌并提取纯化获得重组质粒pG07。　　 二、接合转移实验　　 将具有大肠杆菌-链霉菌接合转移功能的重组质粒pG07转化E.coli ET12567(pUZ8002)，筛选阳性克隆。经一级、二级培养后与经过50℃热激活的出发菌株吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus ATCC29253）单孢子悬液混合，涂布于2CM平板上，16小时后，用一定浓度的安普霉素和萘啶酮酸水溶液覆盖，28℃继续培养。7天后观察是否有阳性克隆长出。　　 三、双交换菌株的筛选　　 挑取接合转移后的阳性克隆菌落，涂布在含有安普霉素的MYM平板上培养。收集孢子制备成孢子悬液，稀释一定倍数后涂布于含有安普霉素的MYM平板上，28℃培养48-72小时，在未形成气生菌丝时，将平板移至42℃继续培养3-4天，能够继续生长的菌株即为单交换菌株。　　 将单交换菌株在不添加抗生素的MYM平板上传代，筛选失去安普霉素抗性的菌株即为双交换重组菌株。　　 四、重组菌株的HPLC分析　　 将筛选出的双交换重组菌株与出发菌株分别传于斜面培养基上，再接种于种子摇瓶内，于28℃培养40小时，转入发酵摇瓶，于28℃培养5天。　　 发酵液提取物采用高效液相色谱（HPLC）进行分析。　　 结果:　　 一、质粒pG07的酶切鉴定　　 将质粒pG07进行酶切验证，并以pG07为模板，进行PCR扩增反应。酶切及PCR产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳，图谱显示酶切后片段的长度与预期结果一致，并且PCR扩增出的片段大小约2853bp，正好为基因缺失后的长度，说明质粒pG07构建正确。　　 二、接合转移实验　　 E.coli ET12567(pUZ8002，pG07)与吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicusATCC29253）共同培养后，在有安普霉素的平皿上有链霉菌的阳性克隆长出，说明质粒pG07携带的安普霉素抗性基因已经在链霉菌中表达，质粒pG07已经成功转入到吸水链霉菌ATCC29253中。　　 三、双交换菌株的筛选及高效液相色谱(HPLC)的分析结果　　 对重组菌株染色体进行PCR验证，结果表明，重组质粒上失活的rapA基因与出发菌株染色体上正常的rapA基因发生了正确的同源双交换。　　 发酵产物的HPLC分析表明:基因重组菌株产生的代谢产物中雷帕霉素的产量显著减少了62％，而另一代谢产物洋橄榄素的产量有所提高。　　 结论:　　 1、成功地删除了吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus ATCC29253）中雷帕霉素生物合成基因簇中的rapA基因的内部片段，造成rapA基因的失活，得到了基因重组菌株。经发酵产物的HPLC分析表明:重组菌株雷帕霉素产量显著减少而洋橄榄素产量有所提高。　　 2、对重组菌株染色体DNA上的rapA基因进行了PCR验证，验证结果表明，重组质粒上被deletion失活的rapA基因与出发菌株染色体上正常的rapA基因发生了正确的同源双交换。