铝毒害是酸性土壤危害农作物生长的关键因素。当人为活动和植物根系活动导致pH低于5.5时,土壤中的铝从不可溶性铝化合物释放出来,形成具有毒性的游离铝。在胞外,铝可螯合细胞壁使细胞壁弹性丧失;而在胞内,铝破坏蛋白和核酸等大分子的结构。为了响应铝毒害,植物进化出胞外和胞内这两种解毒机理:前者主要通过分泌有机酸,特别是苹果酸螯合胞外的游离铝,而后者将胞内的螯合并区域化入液泡内。这两种机理分别需要质膜和液泡膜的质子泵所形成的质子梯度才得以进行。模式植物拟南芥基因组有11个AHAs成员,而液泡膜质子泵分为液泡质子ATP酶(V-ATPase)和液泡质子焦磷酸酶(V-PPase)。V-ATPase的两亚基VHA-a2和VHA-a3以及V-PPase的AVP1控制着植物的生长发育以及抗逆反应。但是,这些液泡质子泵在植物响应外界铝胁迫的作用机理并不清楚。本论文利用植物分子遗传学、植物形态学、荧光化学、分析化学等方法,发现VHA-a2和VHA-a3是拟南芥适应酸化环境铝毒的关键质子泵,并揭示拟南芥通过抑制VHA-a2和VHA-a3活性,以协调胞内有机酸和质子外排,从而确认液泡质子泵调控质膜质子泵和有机酸转运体以实现胞外铝的解毒机理。主要研究内容如下:1.VHA-a2和VHA-a3是拟南芥响应铝毒的关键质子泵首先利用哥伦比亚型背景(Col-0)的野生型(WT)和液泡质子泵VHA-a2和VHA-a3双突变体(vha-a2 a3),发现在酸性条件下,与WT相比,双突变体表现出耐胁迫的生长特性,具有较长的根长和鲜重,而对其它金属钙、锰和锌等敏感。但是,vha-a2或vha-a3单突变体、反面高尔基体网络的质子泵突变体vha-a1,和avp1突变体并不表现出耐铝性。还有,vha-a2 a3 avp1三突变体表现出与vha-a2 a3类似的耐铝生长表型。通过不同pH培养条件分析,发现vha-a2 a3仅在酸性pH<5.4表现出耐铝性。此外、利用不同种类的铝离子化合物(AlCl3和Al2(SO4)3)和不同浓度铝离子的处理,进一步确认vha-a2 a3的特异耐Al3+毒害的表型。通过定量PCR和液泡质子泵活性分析,发现铝处理降低VHA-A2和VHA-A3基因的表达量及其蛋白活性。这些结果表明:VHA-a2和VHA-a3功能冗余调控拟南芥对铝毒的响应。2.VHA-a2和VHA-a3的双突变降低根对铝的吸收植物的根,特别是根尖是铝毒的作用靶点。利用铝离子的染色试剂hematoxylin(苏木精)和荧光试剂morin(铝离子载体I)染色,显微分析在有无Al3+条件下处理下,WT和vha-a2 a3根尖铝含量及分布情况。结果发现,与WT相比较,vha-a2 a3的根尖分生区没有显著的苏木精染色分布,而且该部分的桑色素荧光强度较弱。由于苏木精和桑色素分布特异结合细胞壁和细胞质中的铝,表明vha-a2 a3根尖细胞壁和胞内含较低的铝。为了进一步证实该研究结果,通过ICP-MS分别检测250 μM AlC13处理72小时的WT和vha-a2 a3根,发现vha-a2 a3根的铝含量为WT根的60%。3.质膜质子泵参与vha-a2 a3突变体的耐铝性通过拟南芥根液泡V-ATPase和V-PPase,以及质膜质子泵活性分析,发现V-ATPase和V-PPase活性被A13+处理抑制,而质膜质子泵的活性则被激活。利用q-PCR检测WT和vha-a2 a3根部所表达8个质膜质子泵成员基因(AHA1-AHA4,AHA7,AHA8,AHA10和AHA11)对铝处理的敏感性。结果显示,250 uM Al3+处理12小时后,WT的AHA1,AHA2和AHA7的表达量上调。但是,与WT相比,vha-a2 a3根的这三个基因的表达量进一步提高了 2,4和3倍,表明质膜质子泵,特别是AHA2可能参与vha-a2 a3突变体的耐铝毒性。为了证实该观点,利用aha2突变体植株进行分析,发现与WT相比,该突变体植株表现出对铝处理敏感,而且根含较高的铝含量。为了进一步确认活化的质膜质子泵在vha-a2a3突变体耐铝性中的作用,利用外源添加质膜质子泵激活剂壳梭孢菌素(FC)和抑制剂钒酸纳(VA),发现FC处理导致野生型表现出类似于vha-a2 a3突变体的耐铝生长表现,而VA消除vha-a2 a3突变体的耐铝性。这些结果表明,拟南芥抑制液泡质子泵V-ATPase以进一步激活质膜质子泵,并利用质膜质子泵响应环境的铝胁迫。质膜质子泵将胞内的质子排出,建立质膜两侧的质子梯度。为了分析活化质膜质子泵对质子外排的影响,利用质外体质子荧光染色剂HPTS,在激光共聚焦显微镜观察质外体的酸化情况。在正常情况,vha-a2 a3根的质外体的荧光强度弱于WT。在铝处理条件下,突变体的荧光基本消失,表明vha-a2 a3根胞外的pH值低于WT。通过培养液pH测定,发现vha-a2 a3植株较WT更显著地降低培养液的pH。但是,进一步降低培养条件的pH并不能促进WT和vha-a2 a3植株的耐铝性。可见,质膜的质子外排是vha-a2a3突变体耐铝性的必要条件。4.有机酸外排赋予vha-a2a3突变体耐铝性在铝胁迫条件下,质膜的质子外排导致有机酸,特别是苹果酸和柠檬酸的分泌。为了探讨有机酸分泌的可能作用,分析铝处理是否影响苹果酸转运体ALMT1和柠檬酸转运体MATE1的表达量,以及苹果酸和柠檬酸的分泌。q-PCR检测结果显示,铝处理导致WT根ALMT1和MATE的表达量显著上调,而且vha-a2 a3的突变进一步促进这两个基因的表达。高效液相色谱分析结果发现,铝处理分别提高WT根15.68倍苹果酸和8.42倍柠檬酸的分泌,而与WT相比,vha-a2 a3根的苹果酸和柠檬酸的分泌量进一步提高为182%和118%。但是,vha-a2 a3根内的苹果酸和柠檬酸并类似于和低于WT。外源添加苹果酸和柠檬酸导致WT表现出类似与vha-a2 a3的耐铝生长表型。这些结果建立苹果酸和柠檬酸分泌在vha-a2 a3耐铝性的关键作用。质膜质子泵抑制剂VA消除铝处理促进的WT和vha-a2 a3根的苹果酸和柠檬酸分泌,质膜质子泵激活剂FC不能提高almt1突变体的耐铝性,表明这些有机酸的分泌依赖于质膜质子泵的活化。还有,有机酸转运体药物抑制剂NIF和A-9-C抑制vha-a2 a3耐铝性,而液泡质子泵抑制剂ConA能促进WT苹果酸和柠檬酸分泌,并降低根铝的含量,而对almt1突变体没有影响。这些结果表明,铝诱导的有机酸的分泌依赖于液泡V-ATPase活性降低和质膜质子泵活性激活。5.铝胁迫降低vha-a2a3突变体的钙信号钙信号是植物响应铝胁迫的组分。ICP-MS分析显示,与WT相比,铝处理更显著地降低vha-a2 a3根的钙含量。铝缺乏条件下,与表达钙离子荧光载体YC3.6的WT植株相比,vha-a2 a3背景的根部表现出较弱的荧光。铝处理后,WT和vha-a2 a3背景的钙荧光被抑制,而且后者的钙荧光强度衰退速度快于前者,表明铝胁迫条件下,钙信号正相关与VHA-a2和VHA-a3的表达。为了分析铝抑制VHA-a2和VHA-a3的表达是否为钙信号减弱的结果,我们利用液泡钙吸收转运体CAX1和CAX3突变体cax1cax3,发现该突变体表现出对铝毒敏感。但是,液泡钙受体CBL2和CBL3突变体cbl2 cbl3表现出与vha-a2 a3相同的铝响应,表明CBL2和CBL3参与调控铝抑制VHA-a2和VHA-a3活性的过程。综上所述,本论文认为,在正常的生长过程中,植物细胞利用液泡质子泵将代谢产生的有机酸存储在液泡内,而在铝胁迫下,液泡质子泵活性降低可导致如下结果:1、减少有机酸进入液泡以提高细胞质中有机酸的含量,为质膜有机酸转运体提供足量的底物;2、激活质膜质子泵,促进质膜两测的质子梯度,为有机酸阴离子的外排提供推动力;3、有机酸转运体活性亦被激活,在足量的底物和极化的质膜质子梯度条件下,高效地将有机酸转运到胞外。从而实现对铝的胞外解毒,以适应铝胁迫。