急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是胰腺的急性炎症性病变,可以由高脂血症、酗酒和胆系疾病等多种病因导致。AP既可以表现为一般的轻度水肿型炎症,也可以表现为具有致命性的重症炎症。根据AP患者的局部或全身并发症以及是否存在一过性或持续性脏器衰竭情况,可以将AP患者分为轻症急性胰腺炎(mild acute pancreatitis,MAP)、中度重症急性胰腺炎(moderate severe acute pancreatitis,MSAP)和重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)。AP患者的预后差异很大,MAP的预后较好,病死率接近0%,而SAP病情严重,预后较差。SAP的特征是患者伴有持续性脏器衰竭,即脏器衰竭时间超过48h。在所有AP患者中10%~20%可能出现持续性脏器衰竭,患者死亡率可以达到30%~50%。miRNAs是一类高度保守的短链非编码RNA,其长度约为17-25个核苷酸,可以在转录后水平调节目的基因的表达。miRNAs通过碱基互补配对与编码蛋白的m RNA的3’端非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)相结合,负性调控靶基因的表达水平。据估计miRNAs对哺乳动物超过30%的蛋白编码基因具有活性调控作用。由于miRNAs在基因调控中具有重要的作用,其表达水平在众多生理、病理条件下均有显著改变。在多种疾病的发生过程中,miRNAs在病变组织或循环血等体液中的含量发生变化。为了进一步研究AP患者循环血miRNAs表达水平变化情况,寻找早期诊断AP病情严重程度的miRNAs标志物,以及明确miRNAs在AP发生发展过程中的调控作用和具体分子机制,本课题运用动物实验、细胞学实验和分子生物学等方法,对上述问题进行了研究。一、急性胰腺炎患者血浆中miRNAs的异常表达研究 目的:研究AP患者循环血miRNAs表达水平的特点以及循环血miRNAs在MAP与SAP患者之间的表达差异。方法:分别收集健康对照者、MAP患者以及SAP患者的血液样本。抽提患者血浆总RNA,并对RNA样本质量进行检测。以芯片法检测患者循环血血浆中miRNAs表达的差异。结果:AP患者的循环血血浆中的miRNAs表达水平有着较明显的改变。AP患者与正常对照者相比较,循环血血浆中有75种miRNAs含量有明显改变(改变2倍以上,P<0.05者),其中55种miRNAs表达升高,20种miRNAs表达降低。在AP患者中,MAP患者的循环血血浆miRNAs表达水平改变较为轻微,MAP患者与健康对照相比,其循环血血浆中共有19种miRNAs发生显著变化,其中有14种miRNAs表达升高,5种miRNAs表达下降。而SAP患者血浆miRNAs变化则较为显著,与健康对照者相比较,血浆中共有177种miRNAs发生明显变化,其中135种miRNAs显著升高,而42种miRNAs显著下降。此外,SAP患者与MAP患者相比较,其循环血血浆中的miRNAs表达也具有明显的差异,SAP患者与MAP患者相比较,其血浆中80种miRNAs含量有明显改变,其中57种miRNAs表达升高,23中miRNAs表达降低。结论:AP患者与健康对照相比,循环血血浆中miRNAs的表达水平有着显著的差异,提示miRNAs在AP的发生发展中可能发挥着重要的调控作用。SAP患者循环血血浆中miRNAs的表达与MAP患者具有明显的差异。为本研究为未来研究miRNAs在AP中的调节作用以及寻找诊断SAP的miRNAs生物学标志物奠定了研究基础。二、循环血miRNAs标志物早期诊断SAP研究 目的:研究SAP与MAP和MSAP患者之间循环血血浆miRNAs表达差异,寻找早期诊断SAP的miRNAs标志物。方法:采用前瞻性的方法,在AP患者入院时采集患者血液样本。抽取AP患者循环血血浆RNA,采用RT-q PCR的方法,检测患者循环血血浆中特定miRNAs的表达水平,并分析各组间的差异。采用ROC曲线的方法,分析循环血血浆miRNAs标志物诊断SAP的特异性和敏感性。结果:在本研究检测的血浆miRNAs之中,有12种miRNAs(miR-1208、miR-3127-5p、miR-3180-3p、miR-3187-3p、miR-4265、miR-4294、miR-4513、miR-4725-3p、miR-4776-5p、miR-516a-3p、miR-6083和miR-770-5p)在SAP患者的血浆中表达水平显著升高,与MAP组和MSAP组患者相比,其升高均具有统计学差异(P<0.05)。ROC曲线分析显示12种miRNAs均可以用作AP病情严重程度分级的指标,其中miR-1208(AUC 0.88,敏感性80.95%,特异性84.88%,P<0.001)、miR-3180-3p(AUC0.914,敏感性80.95%,特异性88.37%,P<0.001)、miR-4265(AUC 0.881,敏感性80.95%,特异性86.05%,P<0.001)和miR-4776-5p(AUC 0.896,敏感性90.48%,特异性76.74%,P<0.001)用于AP病情严重分级效果较好,具有较高的敏感性和特异性。结论:SAP患者与MAP和MSAP患者相比,循环血血浆中的多种miRNAs表达水平具有显著差异。循环血血浆miRNAs可以作为诊断SAP的标志物,具有较高的特异性和敏感性。三、miRNA-494在AP中的表达及其调节胰腺腺泡细胞凋亡的机制研究目的:研究在AP条件下胰腺miR-494表达水平的改变,以及其对胰腺腺泡细胞凋亡的调节作用及具体分子机制。方法:构建雨蛙素诱导的AP小鼠模型和AR42J细胞模型,采用病理学检查、检测血清及细胞培养上清液中淀粉酶、TNF-α、IL-1和IL-6等AP标志物的方法验证造模情况。采用RT-q PCR的方法,检测AP条件下胰腺miR-494表达水平的改变。采用流式细胞法分析miR-494对胰腺腺泡细胞凋亡的调节作用。采用Western blot的方法,检测miR-494可能的下游凋亡相关蛋白改变情况,寻找miR-494调节胰腺腺泡细胞凋亡的具体分子机制。结果:AP组小鼠胰腺组织损伤严重,出现典型的AP表现。淀粉酶及炎性分子在AP组明显升高,造模成功。miR-494在AP条件下表达显著升高。miR-494可以抑制胰腺腺泡细胞凋亡。Western blot显示,miR-494对促凋亡蛋白ROCK1、PTEN和CAMKIIδ具有抑制作用。结论:在AP条件下,胰腺miR-494的表达上调。miR-494通过靶向抑制ROCK1、PTEN和CAMKIIδ等促凋亡蛋白的表达,抑制胰腺腺泡细胞的凋亡。四、TGF-β/Smad3通路转录调控miR-494机制研究目的:研究在AP条件下,引起胰腺miR-494表达水平升高的具体分子机制。方法:通过Western blot的方法检测p Smad3的表达情况,观察AP条件下TGF-β信号通路的活性改变。观察TGF-β对胰腺腺泡细胞miR-494表达水平的调节作用。采用启动子序列分析的方法,寻找miR-494启动子序列的Smad蛋白结合位点。通过构建包含miR-494启动子序列的荧光素酶报告基因质粒,采用双荧光素酶报告基因检测的方法研究TGF-β对miR-494启动子活性的调节作用。结果:在AP条件下,p Smad3的表达水平升高,胰腺的TGF-β信号通路激活。TGF-β可以上调胰腺腺泡细胞中miR-494的表达水平。miR-494的启动子序列中含有多个Smad3的结合位点。TGF-β可以上调miR-494启动子的活性。结论:在AP条件下,TGF-β信号通路的活性升高,TGF-β/Smad3通过上调miR-494启动子的活性,调节miR-494的表达水平。