在修复重建外科,各种原因如:先天遗传、后天损伤、肿瘤及炎性反应等造成的软骨缺损很常见,由于软骨自身修复能力有限,缺损部分通常由纤维组织或致密疤痕代替,其外形和功能与天生软骨相距甚远。目前,临床软骨缺损的修复多采用人工替代物或自体/异体软骨移植进行治疗,人工软骨代用品外观类似,但不能实现功能替代[1];软骨移植又存在着供区不足、取材创伤大、移植区易发生病变、软骨表型和功能难以维持等缺点[2-3]。因此,临床上找到一种获取简易,创伤较小,外形及功能俱佳的软骨来源成为了一项急需解决的难题。近年来,组织工程学在修复重建外科的兴起和发展,为软骨修复提供了一种新的思路。组织工程学是利用种子细胞与支架材料相结合进行器官组织构建的一门新兴学科,其核心三要素是种子细胞、支架材料、诱导构建模式[4-5]。种子细胞是组织工程首要因素,理想的软骨种子细胞应当符合如下条件:1)来源丰富,创伤微小;2)稳定扩增,可短时间获足够数量;3)表型稳定,不易突变等[6]。因而选择适宜的软骨种子细胞成为组织工程软骨构建首要解决的问题。脂肪来源十细胞/脂肪干细胞（Adipose derived Stem Cells,ASCs/ADSCs）是来源于脂肪组织的一种成体干细胞,ADSCs在机体中广泛分布、来源丰富、易获取,是一种潜在的组织工程种子细胞[7-8]。ADSCs进入医学舞台是从Zuk等首次从脂肪组织中提取了ADSCs并进行了深入的研究,证明经过特定诱导后可分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞[9]。本实验室前期研究发现在转化生长因子1（Transforming growth factor β1,TGFβ 1）作用下,ADSCs可以向软骨细胞（Auricular Chondrocytes,ACs）分化并构建ADSCs材料复合物,将诱导后的细胞材料复合移植到猪的膝关节软骨缺损中,部分修复了膝关节非负重区的软骨缺损,佐证了 TGF β 1在ADSCs进行组织工程软骨构建的有效性[10-11]。在 TGF 因子家族中,TGF β 1 和转化生长因子 3（Transforming growth factor β3,TGFβ 3）在细胞早期分化及损伤修复中都具有启动和诱导作用,都具有促进ADSCs向ACs分化的能[12]。近期研究发现TGF β 3在ADSCs向ACs分化方面可能更具优势,TGFβ3是软骨细胞谱系分化的重要启动因子,通过Wnt/b-catenin胞内通路可以迅速启动软骨谱系分化,显著增强了细胞群中Ⅱ型胶原蛋白（ColⅡ）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan,Agg）的表达[13],与此同时其还基于SMAD信号通路实现软骨修复并加速软骨分化的生物学作用[14];Li等发现除通过以上2个信号通路发挥软骨诱导作用外,TGF β 3还控制基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase Protein,MMP）的产生,激活基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）的表达,从而促进软骨相关胶原和细胞外基质的分泌[15];此外,在ADSCs缺氧诱导实验中,TGFβ3阻止脂肪组织提取ADSCs进入细胞凋亡周期,减少ADSCs的细胞凋亡及提高DNA修复,保护了 ADSCs的增殖数量[16],以上研究表明TGFβ3可能具有强大的软骨诱导潜能,在组织工程软骨构建中有望达到更好的软骨构建效果。目前关于TGFβ 1与ADSCs向软骨诱导分化的研究较多,而TGFβ3在ADSCs向软骨的诱导分化,乃至在体外/体内环境下构建组织工程三维软骨还相对空白,值得进一步研究和探讨。同样,诱导构建模式作为组织工程重要因素之一,是否能高效稳定的建立适宜的细胞培养诱导模式也决定了组织工程软骨优略。细胞共培养诱导是将两种或多种不同细胞混合培养,通过不同细胞相互作用以及分泌细胞因子基质对彼此的影响来获得期望诱导效果的培养诱导模式[17-19]。研究表明将ADSCs与ACs共培养下,不仅ADSCs的分化效率提高,ACs的增殖率和软骨基质表达也有所增加。Huang等发现将未处理的ACs与成体干细胞（MSCs）共培养后,MSCs持续表达软骨表型并分化为软骨细胞[20]。Cai等[21]将ADSCs与ACs共培养形成细胞微团块（macromass）,不仅在体外环境下ADSCs向ACs表型分化,植入裸鼠体内环境后,共培养macromass团块的软骨分化不断成熟,基质表达也要优于单一培养组,以上研究结果都提示细胞共培养模式在组织工程软骨构建中的可行性和潜在应用价值。基于前期实验对于ADSCs在组织工程软骨中的相关研究基础和文献支持,本实验设想联合TGFβ3诱导和ADSCs+ACs共培养这两种诱导模式相结合,采用此双相诱导模式进行组织工程软骨构建,评价双相诱导模式在体外/体内环境下进行组织工程软骨构建的可行性,以期获得一种更优化的组织工程软骨,提高构建效能。[目的]探讨在TGFβ3诱导以及ADSCs+ACs共培养的双相诱导模式下,ADSCs在体/内外环境下构建组织工程软骨的可能性,评判TGFβ3诱导与ADSCs+ACs细胞共培养的双相诱导模式的软骨构建效能。[方法]1细胞水平下,脂肪干细胞向软骨细胞诱导分化的实验研究:手术切取猪腹部脂肪组织和外耳软骨,酶消化法获取ADSCs及ACs。观察体外扩增能力,并收集第二代脂肪来源细胞进行流式细胞ADSCs种群特异抗原标志物鉴定,排除细胞混杂干扰;确定ADSCs种属后,分别进行成骨诱导、成软骨诱导和成脂肪诱导确定分化潜能鉴定,确定此次ADSCs的分化潜能。根据前期实验及文献支持配置TGFβ3诱导液备用（10ng/mlTGF-b3,10ng/ml BMP6,50ng/ml IGF-1,0.1 uM dexamethasone,50mg/ml VC,40mg/ml proline）。收集P2 ADSCs及ACs进行共培养,两种细胞混合比例为50%:50%,细胞密度以15,000/皿进行混合共培养;另取P2ADSCs及ACs,以1×106ADSCs:1×106ACs混合比例制作共培养组细胞微团块（macromass）,而macromass单一培养组ADSCs及ACs细胞数量均为2×106,各组macromass细胞总数量保持一致。实验共分4组:ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）,ADSCs+ACs组（单一共培养组）,ADSCs+TGFβ3组（单一 TGFβ3组）,ACs+TGFβ3（软骨对照组）组,各组均从二维细胞水平及三维macromass团块进行诱导培养和检测鉴定。经TGFβ3诱导液诱导培养4周后,通过细胞形态学观察、细胞增殖测序、定量逆转录聚合酶链反应、组织切片HE染色、免疫组化染色等方法评价各实验组诱导效能。2体外环境下,脂肪干细胞构建组织工程软骨的实验研究:细胞分离培养同实验一,取 P2 ADSCs 及 ACs,以聚羟基乙酸/聚乳酸（Polyglycolic Acid/Polylactic Acid,PGA/PLA）为支架材料,构建ADSCs/ACs+材料复合体,探讨ADSCs在体外环境下,构建软骨组织的能力。实验分组同实验一,分别设立ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）,ADSCs+ACs组（单一共培养组）,ADSCs+TGFβ3组（单一 TGFβ3组）,ACs+TGFβ3（软骨对照组）组共4组,根据各分组情况,经TGFβ3诱导液对细胞材料复合物体外诱导培养4周。4周后通过大体观、湿重测定、软骨生物力学检测,GAG定量测定、HE染色、免疫组织化学染色和Safranine-O染色等方式,对ADSCs的体外构建软骨组织能力及双相诱导模式进行评价。3体内环境下,脂肪干细胞构建组织工程软骨的实验研究:细胞分离培养及细胞材料复合物的构建同前实验。实验分组设立ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）,ADSCs+ACs 组（单一共培养组）,ADSCs+TGFβ3 组（单一 TGFβ3 组）,ACs+TGFβ3（软骨对照组）组等4组。经过TGFβ3诱导液对细胞材料复合物体外诱导培养2周,而后将诱导后细胞材料复合物转移至裸鼠体内,体内培养4周后取材。经过体外2周+体内4周培育后,通过大体观、湿重测定,软骨生物力学检测,GAG定量测定、HE染色、免疫组织化学染色和Safranine-O染色等方式,对ADSCs的体内构建软骨能力及TGFβ3联合细胞共培养的双相诱导方案进行评价。[结果]1细胞水平下,猪脂肪干细胞向软骨细胞诱导分化的实验研究:接种后的ADSCs的原代细胞24h内处于静止期,24-48h后贴壁生长迅速,ADSCs及ACs的细胞形态由一开始的多角形或不规则形态,经过时间推移逐渐向纺锤体型细胞形态变化,趋于去成纤维细胞的细胞形态。按照实验分组,对ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）,ADSCs+ACs 组（单一共培养组）,ADSCs+TGFβ3 组（单一 TGFβ3 组）,ACs+TGFβ3（软骨对照组）组共4组进行MTT测序分析细胞增殖速率,结果显示ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）增殖速度最快,差异有统计学意义,细胞增殖速率由高到低为ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）＞ACs+TGFβ3组（软骨对照组）＞ADSCs+TGFβ3组（单一 TGFβ3组）＞ADSCs+ACs组（单一共培养组）。流式细胞仪检测P2ADSCs的细胞种属表面特异抗原发现,CD49d、CD13、CD34、CD166阳性表达,这与最初Zuk所得ADSCs鉴定结果相一致,同时排除造血系（CD14和CD45阳性表达）和内皮细胞（CD31阳性表达）的污染。同时P2ADSCs的成骨、成脂肪以及成软骨三向分化鉴定实验均出现阳性显色,确认了实验所用P2 ADSCs的诱导分化潜能。定量PCR检测4个实验组的软骨细胞特异性指标二型胶原（colⅡ）,盒转录因子9（Sox9）以及软骨蛋白聚糖抗体（ACAN）,的mRNA水平,图标结果显示ADSCs+ACs+TGFβ3（双相诱导组）与ACs+TGFβ3组（软骨对照组）表达最强,图标数值均优于其他两组,双相诱导组在col Ⅱ,Sox9以及ACAN的mRNA水平最接近软骨对照组。Micromass诱导4周后,经过大体观察及特殊染色发现4个实验组均有阳性表达,ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）与ACs+TGFβ3组（软骨对照组）形成类软骨组织的团块较好,优于ADSCs+ACs组（单一共培养组）和ADSCs+TGFβ3 组（单一 TGFβ3 组）。ADSCs+ACs+TGFβ3 组（双相诱导组）与 ACs+TGFβ3组（软骨对照组）软骨陷窝结构明显,结构清晰,细胞外基质分泌均匀,提示双相诱导组在各组中软骨分化最接近正常软骨细胞结构。2体外环境下,猪脂肪干细胞构建软骨组织的实验研究:体外环境下细胞材料复合物诱导培养,相差显微镜（×100）及电镜下观察种植细胞密度增高,胞外基质分泌旺盛,且沿着支架孔隙排列分布,细胞与支架材料粘合紧密。4周后,肉眼对比发现四组均形成类似软骨样组织,ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）与ACs+TGFβ3组（软骨对照组）形成类软骨组织体积占比最高,形状良好饱满,ADSCs+TGFβ3组（单一 TGFβ3组）及ADSCs+ACs组（单一共培养组）出现一定皱缩,外观及质地均不及双相诱导组。湿重测定ADSCs+ACs+TGFβ3组:81.32g±0.39g,接近ACs+TGFβ3组:88.32g±0.86g,而 ADSCs+TGFβ3 组:35.02g±0.33g 及 ADSCs+ACs 组:58.25g±0.44g。单一共培养组、单一 TGFβ3组与双相诱导组和软骨对照组有一定差距,差异有统计意义（p＜0.05）。软骨糖胺聚糖GAG（glycosaminoglycan,GAG）定量测定显示ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）与ACs+TGFβ3组（软骨对照组）在15mg左右,较其他两组组含量明显增高;对诱导后软骨组织进行力学检测,以ACs+TGFβ3组（软骨对照组）的数据为标准正常参照,ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）的弹性模块变量数值最接近正常软骨组织,达到正常软骨的90%,说明在双相诱导条件下,构建的软骨样组织与正常软骨组织差异较小。而ADSCs+TGFβ3组（单一 TGFβ3组）及ADSCs+ACs组（单一共培养组）仅为正常软骨组织的50%以下（p＜0.05）。HE染色,免疫组化染色及Safranine-O染色均显示ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）与ACs+TGFβ3组（软骨对照组）软骨陷窝结构丰富,胶原有序致密,细胞外基质均匀致密。ADSCs+ACs组（单一共培养组）也能观察到大部分软骨陷窝结构的存在,细胞外分布一定细胞基质,但软骨细胞成熟度不及ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）。ADSCs+TGFβ3组（单一 TGFβ3组）能观察到少量软骨陷窝结构,纤维组织较多,软骨细胞成熟度较低。3体内环境下,猪脂肪干细胞构建软骨组织的实验研究:细胞材料复合物体外诱导培养2周后,将细胞材料复合物转移至裸鼠体内,体内培养4周后取材。四组实验组均可形成类似软骨组织,各组质地有弹性,饱满度较好,优于体外构建软骨组织,ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）与ACs+TGFβ3组（软骨对照组）形状保持良好,重量明显增加,分别达到98.12g±0.21g和106.78g±0.06g,高于ADSCs+ACs组（单一共培养组）:39.43g±0.11g 及 ADSCs+ACs 组（单一共培养组）81.25g±0.29g,差异有统计学意义。GAG定量测定及生物力学检测均显示ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）与ACs+TGFβ3组优于共培养组及单一 TGFβ3组,差异有统计学意义（p＜0.05）;将体外与体内数据叠加对比发现,体内软骨性状要优于体外结果,提示时间及体内环境对软骨构建的重要性。ADSCs+ACs+TGFβ3组（双相诱导组）与ACs+TGFβ3组切片染色结果显示软骨结构相对成熟,基质丰富致密表达旺盛,层次较清楚;ADSCs+ACs组（单一共培养组）形态次之,部分出现软骨细胞样结构,染色显示colⅡ及GAG阳性表达。ADSCs+TGFβ3组（单一 TGFβ3组）观察到部分软骨细胞凹陷结构,软骨细胞间炎症细胞浸润状态,成纤维样细胞覆盖,软骨细胞成熟度较低。[结论]1在细胞水平下,通过TGFβ3与ADSCs+ACs共培养的双相诱导模式,猪ADSCs可以向软骨细胞表型分化,且TGFβ3及ADSCs+ACs共培养的双相诱导模式具有协同促进作用,两者共同作用效果要大于单一诱导方式。2在体外环境下,通过TGFβ3与ADSCs+ACs共培养的双相诱导模式,猪ADSCs材料复合物可以形成组织工程类软骨组织,具有一定的体外软骨构建能力;体外环境下,TGFβ3及ADSCs+ACs共培养的双相诱导模式具有协同促进作用,两者共同作用效果要大于单一诱导方式。3、在体内环境下,通过TGFβ3与ADSCs+ACs共培养的双相诱导模式,猪ADSCs材料复合物可以形成组织工程类软骨组织,具有一定的体内软骨构建能力;体内环境下,TGFβ3及ADSCs+ACs共培养的双相诱导模式具有协同促进作用,两者共同作用效果要大于单一诱导方式。