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目的:单宁酸广泛存在于非粮饲料中,其毒性作用是限制非粮饲料临床使用的重要原因之一,阐明单宁酸对动物细胞的毒性作用机制,对于预防饲料单宁酸中毒、削减饲料抗营养因子以及单宁酸的临床开发利用具有重要意义。研究单宁酸对猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)的体外毒性剂量以及毒性机理,为临床使用单宁酸提供理论基础和实验依据。方法:本实验以IPEC-J2细胞系为研究对象,用2.5、10和40μM的单宁酸处理24h后,进行以下实验:(1)单宁酸致IPEC-J2细胞氧化损伤:IPEC-J2细胞单宁酸处理24h,使用MTT法检测细胞增值率;检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)的活性和谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量;荧光检测活性氧(ROS)的含量。(2)单宁酸致IPEC-J2细胞DNA损伤:采用酶联免疫吸附测定细胞内8-羟基脱氧鸟苷水平。(3)单宁酸致IPEC-J2细胞线粒体损伤:荧光检测线粒体膜电位变化;比色法检测细胞内腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量。(4)单宁酸致IPEC-J2细胞凋亡:蛋白质印迹法检测线粒体凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、PARP和Caspase-9的表达;分别检测线粒体上和细胞浆中细胞色素c(Cytochrome c Cyt c)的含量;流式细胞仪检测IPEC-J2细胞的凋亡率。(5)单宁酸致IPEC-J2细胞周期阻滞:蛋白质印迹法检测周期蛋白共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ATM)、P53、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)以及周期蛋白A2(Cyclin A2)的表达;流式细胞仪检测IPEC-J2细胞各时期细胞比例。结果:(1)单宁酸可导致IPEC-J2细胞活力、SOD、CAT和GSH-PX的活性以及GSH含量呈剂量依赖性下降,而MDA和ROS含量则相应增高。(2)单宁酸可升高IPEC-J2细胞内8羟基脱氧鸟苷水平,造成细胞DNA损伤。(3)单宁酸可引起IPEC-J2细胞线粒体膜电位下降,ATP合成减少。(4)单宁酸呈剂量依赖性上调线粒体凋亡信号通路相关蛋白Bax、PARP、Caspase-3和Caspase-9的表达,下调Bcl-2表达,同时促进Cyt c从线粒体上释放入胞浆中。而流式细胞仪检测发现,单宁酸可诱导IPEC-J2细胞凋亡,并呈现剂量依赖性;加入caspase-9抑制剂后,可显著抑制由单宁酸诱导的细胞凋亡。(5)单宁酸导致细胞S期阻滞,上调ATM的磷酸化水平,上调P53的表达,下调CDK2的磷酸化以及Cyclin A2的表达。结论:一定剂量的单宁酸可通过降低抗氧化酶活性,增加细胞内脂质过氧化物含量,促进ROS累积,从而引起细胞氧化应激和线粒体损伤,一方面,通过线粒体途径诱导IPEC-J2细胞凋亡;另一方面,通过造成DNA损伤,诱导IPEC-J2细胞S期阻滞。