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牙髓细胞(hDPCs)具有自我复制更新和多向分化克隆的潜能,可在生物因子的作用下可以向成牙本质细胞分化。骨形态发生蛋-2(BMP-2)和地塞米松(DXM)是常见的成骨诱导因子,可以使牙髓细胞向成牙本质样细胞诱导分化。在成牙本质细胞形成过程中亦发挥着重要作用。本研究的目的为探讨BMP-2和DXM在诱导牙髓细胞增殖和牙向分化的作用以及两者联合运用是否能增强诱导效果,为牙髓细胞分化的实验提供生物因子优化组合的实验依据。目的:1、建立hDPCs培养模型,体外分离并培养hDPCs,鉴定细胞来源。2、探讨BMP-2和DXM以及两者联合作用矿化及诱导hDPCs体外增殖及向成牙本质细胞分化的影响。方法:1、hDPCs的体外分离、培养及鉴定:收集我院外科门诊15-30周岁患者无牙体牙髓牙周疾病的正畸牙或智齿,半小时之内迅速至无菌条件下劈开牙体取出髓腔中牙髓组织,并将其剪成1mm3小块,置于培养瓶中,加入含20%优质胎牛血清的高糖DMEM培养液,于恒温培养箱中培养,设置条件为37℃、5%CO2浓度。待细胞生长融合至25cm3培养瓶瓶底80%后,用无菌巴氏吸管加入0.25%胰酶,消化传代细胞。取生长状态良好的第3-5代细胞行波形蛋白和角蛋白免疫化学染色鉴定。冻存稳定传代的3-6代hDPCs待用。2、BMP-2和DXM分别及联合作用对hDPCs增殖的影响:用浓度为BMP-2(100ng/ml)、DXM(1×10-8mol/l)、BMP-2(100ng/ml)+DXM(1×10-8mol/l)诱导稳定传代的hDPCs,与对照组比较(仅含10%FBS的高糖DMEM培养液),在1day、3day、5day、7day消化细胞,制成细胞悬浊液,计数,绘制各组细胞生长曲线。3、BMP-2和DXM分别及联合作用对h DPC向成牙本质细胞分化的影响:诱导步骤同上,利用RT-PCR检测BMP-2和DXM分别及联合作用5day、7day后成牙本质标记基因DSPP、ALP、DMP-1的表达。作用14day后进行碱性磷酸酶染色检测ALP活性。作用21day,进行茜素红矿化结节染色,定量检测矿化结节分析成牙本质分化情况。结果:1、hDPCs的体外分离、培养及鉴定:(1)培养3-5天后,可见有梭型纤维状细胞爬出,7天左右细胞密集生长融合至瓶底的80%,可稳定传代,保持一定生长能力。(3)经波形蛋白、角蛋白免疫化学染色可见,细胞波形蛋白阳性表达,角蛋白阴性表达,说明培养的细胞来源于间叶组织中胚层,符合牙髓细胞的生物学特征。2、BMP-2和DXM分别及联合作用对hDPCs增殖的影响:随培养时间延长,各组细胞数均逐渐增加,5 d时达峰值,后逐渐下降,7 d降至3 d时水平。培养1d时,各组细胞数无明显差异(P>0.05);培养3 d时BMP-2组、BMP-2+DXM组细胞数显著高于DXM、对照组(P<0.05)BMP-2组、BMP-2+DXM组间无明显差异,DXM组、对照组间无明显差异(P>0.05);5 d时BMP-2、DXM、BMP-2+DXM组细胞数显著高于对照组,BMP-2+DXM组>BMP-2组>DXM组>对照组(P<0.05);7d时细胞数下降,BMP-2+DXM组>BMP-2组>对照组>DXM组(P<0.05)。3、BMP-2和DXM分别及联合作用对hDPCs分化的影响:经诱导后各处组的成牙本质形成标记基因DSPP、DMP-1、ALP均有表达,碱性磷酸酶染色染色阳性,矿化结节茜素红染色阳性,说明牙髓细胞可以在BMP-2、DXM的诱导下分化为成牙本质细胞,RT-PCR检测示,经诱导5d,BMP-2、DXM、BMP-2+DXM组细胞的ALP、DSPP、DMP-1表达较对照组均上调,其中BMP-2+DXM组表达最高。BMP-2组与DXM组无统计学差异(P>0.05),与BMP-2+DXM组、对两组有差异(P<0.05);DXM组与BMP-2组无统计学差异(P>0.05),与BMP-2+DXM组、对两组有差异(P<0.05);BMP-2+DXM组、对照组与其他组间均存在差异(P<0.05);提示经BMP-2和DXM诱导后各组hDPCs的分化标志基因强烈表达。经诱导7d各处理组基因表达量趋于同化平稳。DSPP基因表达量BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组大于对照组(P<0.05),但BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组的组间比较无明显差异(P>0.05);同时,ALP、DMP-1基因表达量四个组间无明显差异(P>0.05)。培养14 d,经碱性磷酸酶染色检测,BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组、对照组可见不同着色程度的紫黑色沉淀,其中BMP-2+DXM组着色程度最深,表现为强阳性;经半定量测定阳性染色率:BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组、对照组依次为0.368±0.004,0.337±0.022,0.849±0.013,0.181±0.008,BMP-2+DXM组>BMP-2组≈DXM组>D组,BMP-2+DXM组、对照组与其他各组均有差异,差异有统计学意义(P<0.05),BMP-2组、DXM组差异无统计学意义(P>0.05),与BMP-2+DXM组、对照组均有差异,差异有统计学意义(P<0.05)。培养21d,茜素红染色示,BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组均出现大小及着色程度不一的橘红色矿化结节,其中BMP-2+DXM组矿化结节呈片状大面积分布,BMP-2组、DXM组呈散在分布;对照组无矿化结节形成。BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组、对照组A值比较为BMP-2+DXM组>BMP-2组>DXM组>对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1、利用组织块培养法分离培养hDPCs,可以成功获得稳定传代的牙髓细胞系,为后续各部分实验提供了基础。2、探究并比较了BMP2和DXM两者联合和单独作用对牙髓细胞增殖和分化的影响,丰富了对牙髓细胞分化机制作用的认识,为研究促进牙髓细胞增殖作用和分化作用的细胞因子组合及作用时间提供了依据。