肉毒毒素是世界上已知毒性最强的物质,肉毒中毒事件时有发生,主要以食物污染等方式出现。目前主要使用肉毒毒素马血清对肉毒中毒进行治疗,易产生免疫反应副作用,同时对进入神经细胞内的毒素效果很差。因此研发可进入神经细胞的小分子抑制剂是治疗肉毒毒素药物开发的主要方向。但现在还没有合适的小分子抑制剂能用于肉毒中毒的治疗,合适的分析方法的建立对加快抑制剂的筛选和活性验证具有重要意义。本论文建立了两种肉毒毒素内肽酶活性的体外分析方法,同时利用体外分析法筛选得到了有显著抑制内肽酶活性的化合物,主要进行了三部分的研究。　　具体如下：　　第一部分：基于电泳的内肽酶分析法的建立及条件优化　　我们建立了能针对多型肉毒毒素分析的内肽酶分析法。我们设计和构建了一个适用于多型肉毒毒素分析的底物融合蛋白SNVP:从N端到C端依次为SNAP-25残基1-206,6个组氨酸linker序列,VAMP残基1-94,6个组氨酸标签。成功构建工程菌pET-22b-SNVP/Rosetta(DE3),纯化获得纯度为95％的重组SNVP;利用A,B毒素轻链ALc和BLc对其进行反应,证明重组SNVP具有能被ALc和BLc切割的底物活性。　　对以SNVP为底物的基于电泳的内肽酶分析法的缓冲液、pH、反应温度和DTT等条件进行优化得到:最适缓冲液为Hepes缓冲液;最适的pH为6.5-7.5;最适反应温度为37℃;最适的DTT浓度为2.5-5mM,进一步对ALc切割底物SNVP的动力学参数测定得到Km为6.4±0.4mM和kcat值为39±1.5s-1;类似地得到BLc切割底物SNVP的Km和kcat值分别为5.9±0.2mM和45±1.2s-1。　　第二部分:基于双荧光报告分子的内肽酶分析法的建立及条件优化　　为了满足高通量抑制剂筛选的要求,我们设计并构建了基于双荧光报告分子的内肽酶分析方法。首先,成功构建了针对A型和B型毒素的双荧光报告分子的重组表达质粒pET-22b-CYA和pET-22b-CYB;纯化获得纯度为90%左右的双荧光报告分子CYA和CYB,利用ALc和BLc分别对CYA和CYB进行反应,证明CYA只能被ALc识别切割而不能被BLc切割,同样CYB只能被BLc识别切割而不能被ALc切割,说明双荧光报告分子具有型特异专属特征。　　检测ALc酶切CYA的发射波长比率(528/485)的变化,标准化为CYA的变化,与SDS-PAGE分析CYA的直接变化进行相关分析,两种方法得到的结果呈线性相关(R2=0.96),说明可以用荧光波长528与485比值的变化作为底物变化的指标,并可通过标准化确定为底物量的变化。对基于双荧光报告分子的内肽酶分析法的底物浓度和酶浓度、动态检测间隔时间、检测持续时间等条件优化发现:CYA合适的范围为(0.5-32μM);CYB合适的范围为(0.2-32μM);合适的动态检测间隔时间为2min;持续检测合适的时间为(30min-120min)。CYA在内肽酶ALc作用下随时间发射波长比率(528/485)变化范围为0.5-0.9之间;CYB在内肽酶BLc作用下随时时间发射波长比率(528/485)变化范围为0.5-1.5之间。酶动力学参数测定ALc切割底物CYA的值Km为2.33±0.21μM和kcat值为5±0.4s-1;类似地得到BLc切割底物CYB的Km和kcat值分别为17.6±2.6μM和4.16±0.28s-1。　　第三部分:内肽酶体外分析方法在小分子抑制剂筛选中的应用　　利用基于双荧光报告分子的内肽酶分析法对16个化合物进行筛选。测试10μg的化合物对2nMBLc酶解底物CYB的影响,得到抑制率大于20%的有13个,抑制程度从大到小分别为B0,B23,B20,B3,B12,B8,B21,B9,B26,B2,B24,B18,B10,其中B0具有最强的抑制作用,抑制率为95.5±2.9%,其次是B23,抑制率为55.4±2.1%。　　同时利用基于电泳的内肽酶方法分析了16个化合物对BLc的抑制作用,通过电泳结果直观可以看出在相同剂量下B23的抑制效果最好,几乎完全抑制BLc酶活,其次是B0,其他化合物也表现出不同程度的抑制效果。　　筛选得到的化合物对小鼠肉毒攻毒的保护作用测试发现:化合物与绝对致死剂量的B型毒素共同孵育后腹腔途径攻毒,不同的化合物提供了不同程度的保护效果,B0的保护作用最强,具有呈剂量依赖性,40μg,60μg,80μg的B0可以对受试小鼠分别提供0%(0/5),20%(1/5),60%(3/5)的保护率,当对每只小鼠的化合物用量达到200μg(13.3mg/kg)时,B0可以对小鼠提供完全保护,B12,B23和B24具有80%保护率。