甜瓜泛素连接酶基因CmRMA1H1在果实成熟中功能的初步分析

来源 :内蒙古大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:JK0803_gengjixiang
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甜瓜(Cucumis melo L.)品种河套蜜瓜是葫芦科的双子叶二倍体植物,其果实是典型的呼吸跃变型果实,是内蒙古西部的特色作物,具有重要的经济价值和营养价值。CmRMA1H1基因属于RING型E3泛素连接酶家族,对植物激素信号转导和逆境胁迫等方面有调控作用。本论文以河套蜜瓜为实验材料,克隆了CmRMA1H1基因序列,进行了亚细胞定位,对其进行生物信息学分析显示,其启动子区存在RAV2转录因子调控元件,利用酵母单杂交对其进行了验证;构建超表达和CRISPR/cas9编辑载体,采用花粉管通道法转化甜瓜,对T1代果实和幼苗分别进行成熟表型鉴定和胁迫耐受性分析。主要研究结果如下:(1)克隆CmRMA1H1基因cDNA序列,克隆片段的ORF全长为723 bp,共编码241个氨基酸。生物信息学分析表明,CmRMA1H1蛋白为疏水性、热不稳定蛋白,含有信号肽剪切位点、跨膜结构域、磷酸化位点;蛋白质含有一个高度保守的RING finger结构域;启动子区域含有脱落酸、茉莉酸、赤霉素、干旱、乙烯等应答元件,猜测CmRMA1H1可能参与调控果实成熟和胁迫响应;系统进化树发现甜瓜与葫芦科植物黄瓜的亲缘关系最接近,可能具有相似的功能。(2)构建pCAM-CmRMA1H1载体,进行亚细胞定位分析。结果表明CmRMA1H1基因定位于内质网。(3)CmRMA1H1基因启动子预测发现,序列中含有乙烯响应因子RAV2的作用元件,对其进行了酵母单杂交实验验证。结果表明,CmRAV2转录因子与CmRMA1H1启动子的结合能力较强,CmRAV2蛋白可能参与调控CmRMA1H1基因的表达。(4)检测CmRMA1H1基因在甜瓜不同组织和发育阶段的表达量,分析发现CmRMA1H1基因在跃变后期和跃变期的表达量最高,其表达量分别约是授粉后9 d表达量的1100倍和400倍,表明CmRMA1H1基因可能影响果实的成熟与软化。(5)成功构建超表达载体pPZP221-CmRMA1H1和基因组编辑表达载体pCRI-CmRMA1H1,并转化甜瓜。PCR方法检测T1代转化植株,超表达阳性率为50%,编辑阳性率为30.77%。(6)T1代转化超表达载体的果实较野生型果实早成熟3 d左右,转化编辑载体的果实较野生型果实晚成熟9-15 d左右,表明CmRMA1H1基因可能具有促进果实成熟的作用。对T1代果实平均重量、横径、纵径的测定分析发现,超表达果实显著高于野生型果实,编辑果实显著低于野生型果实,表明CmRMA1H1基因可能影响果实的生长发育;超表达果实的硬度显著低于野生型果实,表明CmRMA1H1可能促进果实成熟后的软化;超表达果实和编辑果实的糖度与野生型果实并无明显差异,表明CmRMA1H1基因的导入并未影响果实的糖度。(7)对阳性T1代果实中CmRMA1H1基因的表达量进行了分析,结果显示,超表达果实中CmRMA1H1基因的表达量极显著高于野生型果实,其中,有两颗果实的表达量分别约是野生型果实的430倍和550倍。编辑果实中CmRMA1H1基因的表达量显著低于野生型果实,其中两颗果实的表达量约是野生型果实的1/90。(8)对T1代甜瓜转化植株的胁迫耐受性分析发现,CmRMA1H1基因对植株的盐胁迫及干旱胁迫具有耐受性。(9)PCR方法检测T2代转化植株,超表达转化植株阳性率为61.04%,编辑转化植株阳性率为20.69%。
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