论文部分内容阅读
研究背景氧化应激损伤参与多种神经系统疾病的发生发展,是研究和治疗中枢神经系统疾病的重要靶点。晚期糖基化终产物受体(The receptor for advanced glycation end products,RAGE)是跨膜蛋白,属于受体的免疫球蛋白超家族,RAGE能与多种配体相结合,广泛参与炎症级联反应和细胞迁移过程。RAGE在胚胎发育期间的大脑中,是组成性表达的;成年后出现下调,而其水平又在老年个体中升高。实际上,RAGE的表达在生理条件下较低,在外界刺激下,RAGE通过上调参与炎症级联反应。近年来,有研究表明,脑缺血损伤后缺血区神经元RAGE的表达增加,而通过调控RAGE可以提高神经元的存活率。RAGE在神经元氧化应激损伤过程中具有重要作用,然而,其具体机制尚不明确。细胞自噬可以清除多余和受损的细胞器、变性的蛋白,帮助细胞适应不断变化的营养条件,维持细胞的内稳态,然而,自噬是一把双刃剑,有研究表明,在某些条件下,如氧化应激和过度的炎症反应会引起过度激活自噬,从而促进细胞凋亡。最近的研究表明,RAGE诱导的自噬在胰腺癌的早期转移中其重要作用,自噬增加导致IL-6的诱导、STAT3的活化及其向线粒体的易位,导致三磷酸腺苷(ATP)产生增加和癌细胞增殖;RAGE缺乏能通过AMPK/mTOR信号通路促进细胞自噬作用。本研究拟构建过氧化氢(Hydrogenperoxide,H2O2)诱导HT22海马神经元氧化损伤模型,探讨RAGE调控自噬对HT22海马神经元存活的影响及其相关的机制,并利用基因敲减技术,深入探讨氧化损伤促进神经元凋亡作用的调控位点,旨在阐明RAGE在神经元氧化损伤中的核心机制,为临床上脑缺血-再灌注损伤的治疗提供新的理论依据。研究目的本研究通过构建H2O2诱导HT22海马神经元细胞氧化损伤模型,观察HT22海马神经元细胞RAGE的表达水平和自噬水平,并通过慢病毒靶向敲减RAGE基因,深入探讨RAGE调控细胞自噬在神经元氧化应激损伤中的作用和相关机制。研究方法本项目拟通过体外实验研究以下内容:(1)构建H2O2诱导体HT22海马神经元细胞氧化损伤模型,模拟神经元氧化损伤,应用CCK8细胞活性检测细胞损伤程度,应用Western Blot检测细胞中RAGE表达水平;(2)构建慢病毒载体RAGE敲减HT22海马神经元细胞系,通过quantitative RT-PCR(qRT-PCR)和Western Blot验证HT22RAGE敲减的效率;(3)应用RAGE抑制剂、NF-κB抑制剂和RAGE(-/-)模型,分别观察H2O2诱导HT22海马神经元细胞氧化损伤后,HMGB1、NF-κB表达水平,以及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B、p62的表达水平,免疫荧光法检测LC3B-II表达水平;应用透射电镜观察细胞自噬体数量,研究RAGE/NF-κB调控自噬在过氧化氢诱导HT22细胞氧化损伤模型中的作用。研究结果(1)H2O2诱导HT22海马神经元细胞氧化损伤后,RAGE表达水平上升,细胞自噬水平增加,损伤程度与H2O2的浓度存在依赖关系。(2)H2O2诱导HT22细胞损伤模型中,自噬水平增高,而通过敲减RAGE基因或使用RAGE抑制剂,H2O2诱导的氧化损伤介导自噬的作用显著下降,并且减轻H2O2诱导的细胞氧化损伤作用,提高了 HT22海马神经元的生存率。(3)H2O2诱导HT22海马神经元细胞氧化损伤模型中,抑制RAGE减少了 HMGB1表达,降低了NF-κB的活性,抑制NF-κB活性则降低了 H2O2对HMGB1表达的影响;同时H2O2对自噬的介导激活作用也显著下降。研究结论H2O2诱导的氧化应激作用促进细胞RAGE蛋白表达,并通过激活NF-κB/HMGB1信号通路调控自噬水平;抑制RAGE蛋白表达,有助于降低H2O2诱导的过度自噬水平,促进HT22海马神经元存活。