目的:锰（Manganese,Mn）是人体必需的微量元素,并作为多种代谢酶和抗氧化酶的辅助因子在各种生理过程和酶促反应中发挥着重要作用。锰也是重金属环境污染物,可以通过血脑屏障和血脑脊液屏障进入到中枢神经系统,在纹状体中优先积累并诱发锰中毒。在过去的几十年中,越来越多的研究集中在锰诱导线粒体功能障碍的细胞和分子机制上。有研究表明,锰对线粒体有很强的亲和力,并且锰的神经毒性与线粒体功能障碍有很强的关联。线粒体的主要作用是为细胞提供高效的能量支持,其作为细胞调节因子,在神经退行性疾病中的作用不容小觑,并且其功能障碍是神经变性的典型病理特点。而线粒体通过自噬选择性降解是线粒体损伤的重要调节方式,对于维持神经元的健康来说必不可少,也是维持线粒体稳态的关键过程。近年来,越来越多的证据显示PTEN诱导激酶1（PTEN-induced putative kinase 1,PINK1）/Parkin通路调节自噬过程中的缺陷与神经退行性疾病的病理学有关,它可以阻止线粒体内有毒物质的积累,在线粒体损伤保护过程中发挥着重要作用。研究表明,锰会引起细胞α-突触核蛋白（Alpha-synuclein,α-Syn）水平增加并导致α-Syn寡聚化。α-Syn是一种高度保守的神经元蛋白,在哺乳动物大脑突触前膜上的表达。在病理条件时,α-Syn进行特殊构象并自聚集,最终导致神经变性。α-Syn与神经退行性疾病的发展过程紧紧相连,并与线粒体功能障碍有双向相互作用。有研究表明,α-Syn会与线粒体共定位,因此我们推测,锰诱导的α-Syn高表达参与了PINK1/Parkin通路调节的自噬,并对线粒体功能产生了影响。尽管先前的研究已经证实锰会诱导α-Syn高表达,但α-Syn与线粒体功能障碍之间的关系还很模糊。本研究首先建立Wistar大鼠锰中毒模型研究锰诱导的α-Syn与线粒体损伤的关系,再通过SH-SY5Y细胞系研究α-Syn对PINK1/Parkin介导的线粒体自噬的影响。此研究为临床诊断和治疗锰神经毒性和其他相关神经退行性疾病提供了新思路及依据。研究方法:选用10周龄Wistar大鼠40只,随机为4组,每一组雌雄各5只。将第1组为对照组,皮下注射0.9%Na Cl;第2组为低锰组,皮下注射15 mg/kg Mn Cl2;第3组为中锰组,皮下注射30 mg/kg Mn Cl2;第4组为高锰组,皮下注射60 mg/kg Mn Cl2。按照5ml/kg的量进行注射,持续6周,1周5次,并记录体重变化。然后进行行为学测试,包括旷场实验和步态分析;采用微波消解-原子吸收法检测大鼠纹状体锰含量;利用流式细胞术检测细胞凋亡水平、细胞活性氧水平、线粒体活性氧及膜电位水平;检测ATP水平;应用Western Blot技术检测Cyt-C、Bax、Bcl-2、LC3B-II/LC3B-I、SQSTM1/p62、TOMM20、COX IV、PINK1、Parkin和α-Syn水平表达情况;测定Parkin磷酸化水平;观察LC3B和线粒体膜通道蛋白VDAC1共定位;免疫荧光法检测α-Syn与VDAC1共定位;免疫共沉淀检测α-Syn与VDAC1蛋白相互作用。利用SH-SY5Y细胞系进行两部分实验。第一部分:研究锰暴露与线粒体的关系及其对线粒体自噬的影响。实验分为四组,第1组为对照组（培养液）;第2、3、4组分别为低、中、高剂量染锰组（50、100、200μM Mn Cl2）;测定CCK-8和LDH的含量;检测细胞凋亡水平、细胞活性氧水平、线粒体活性氧及膜电位水平;检测ATP水平;利用Western Blot技术分析LC3B-II/LC3B-I、SQSTM1/p62、TOMM20和COX IV蛋白表达量。第二部分:通过敲减α-Syn来探究锰诱导α-Syn高表达与线粒体自噬之间的关系。用0和200μM Mn Cl2分别处理正常未转染的细胞、慢病毒转染α-Syn sh RNA的细胞和慢病毒转染阴性sh RNA的细胞,时间均为24小时,Mn Cl2处理浓度是200μM。实验分6组,第1组为对照组（培养液）;第2组为染锰组（200μM Mn Cl2）;第3组为LV-α-Syn sh RNA;第4组为LV-α-Syn sh RNA+锰;第5组为LV-阴性sh RNA;第6组为LV-阴性sh RNA+锰。测定CCK-8和LDH的含量;利用Western Blot技术分析α-Syn表达量;邻位连接技术结合免疫共沉淀分析α-Syn与PINK1相互作用;邻位连接技术结合免疫共沉淀分析α-Syn与VDAC1相互作用;测定Parkin磷酸化水平;免疫荧光法检测p-Parkin与线粒体共定位;邻位连接技术结合免疫共沉淀分析LC3B与VDAC1相互作用;检测线粒体与溶酶体共定位;流式检测细胞凋亡水平、线粒体活性氧和及膜电位水平。结果:在旷场实验中,与对照组相比,60 mg/kg锰导致了大鼠中心区停留时间缩短,移动速度下降和总移动距离减少。步态实验中,60 mg/kg组大鼠运动协调性和平衡力下降,说明锰中毒模型建立成功,并且随着锰剂量的增加,大鼠纹状体中锰含量和神经细胞凋亡率也随之呈剂量依赖性增加。WB结果显示锰会增加Cyt-C、Bax和Bcl-2蛋白表达水平,15 mg/kg锰处理组Bax/Bcl-2蛋白表达量比值与对照组相比无明显差异,30 mg/kg和60 mg/kg锰处理组的比值显著升高。与对照组相比,处理组大鼠ATP水平和MMP水平均明显降低,而细胞ROS和线粒体ROS水平均明显提升。WB结果显示,与对照组相比,LC3B-II/LC3B-I的比率在锰处理组大鼠中明显增加,SQSTM1/p62、TOMM20和COX IV均下降。而与30 mg/kg锰处理的大鼠相比,60 mg/kg锰处理的大鼠LC3B-II/LC3B-I比率降低,SQSTM1/p62、TOMM20和COX IV水平增加。免疫荧光结果显示,LC3B与VDAC1共定位在15 mg/kg和30 mg/kg组增加,60 mg/kg组与30 mg/kg组相比略有下降。免疫共沉淀也得到了相同趋势的结果,LC3B与VDAC1的相互作用在15 mg/kg和30 mg/kg组增加,60 mg/kg组与30 mg/kg组相比略有下降。此外,与对照组相比,PINK1和Parkin蛋白表达水平随着锰剂量增加而增加,而p-Parkin水平在15 mg/kg和30 mg/kg组增加,60 mg/kg与30 mg/kg组相比有所下降。与对照组相比,α-Syn表达量随着锰剂量升高而升高,并且锰也显著增加了α-Syn与线粒体的共定位,以及α-Syn与VDAC1的相互作用。细胞毒性实验的检测结果显示,在染锰时间为24h时最有利于区分不同剂量对细胞毒性作用产生的差异,因此,本研究后续所有实验中的锰暴露时间均为24h。随着锰剂量的增加,细胞活力降低,LDH释放量增加,且呈现剂量-依赖关系。流式结果显示,锰导致了细胞凋亡率升高,细胞ROS和线粒体ROS水平显著增加,线粒体膜电位大幅下降。锰也降低了细胞ATP水平。与对照组相比,LC3B-II/LC3B-I的比率在锰处理组细胞中明显增加,SQSTM1/p62、TOMM20和COX IV均下降。而与100μM锰处理组细胞相比,200μM锰处理组细胞LC3B-II/LC3B-I比率降低,SQSTM1/p62、TOMM20和COX IV水平增加。随后,慢病毒转染干扰α-Syn表达有效的降低了α-Syn m RNA和蛋白的表达水平,并且慢病毒阴性组对细胞无干扰。与对照组相比,锰增加了α-Syn表达水平以及α-Syn与VDAC1的相互作用,而敲减α-Syn缓解了锰诱导的α-Syn高表达以及α-Syn与VDAC1的相互作用。锰导致了α-Syn与PINK1相互作用增加,而敲减α-Syn后,这种相互作用显著降低。WB和免疫荧光实验结果显示,锰处理会增加Parkin磷酸化水平以及p-Parkin与线粒体的共定位,而敲减α-Syn会使Parkin磷酸化水平和p-Parkin与线粒体的共定位进一步增加。并且相比于正常细胞锰处理,敲减α-Syn后对细胞进行锰处理,LC3B与VDAC1的相互作用增加,线粒体与溶酶体的共定位也显著增加。敲减α-Syn后,锰所致的细胞凋亡率下降,ATP生成增加,线粒体活性氧水平下降,并且线粒体膜电位有了回升,线粒体损伤程度减小。结论:锰会诱导α-Syn高表达,并且高表达的α-Syn定位于线粒体,干扰了PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,从而加重了线粒体损伤。