目的:蛋白尿是慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD)的共同表现,大量蛋白尿可引起肾小管及间质的损伤和炎症。而与白蛋白(albumin,Alb)结合的游离脂肪酸(free fat acids,FFAs)通过脂毒性,引起细胞功能障碍和损伤,参与了肾间质损伤的过程。已有研究表明饱和脂肪酸棕榈酸(Palmitic acids,PA)可诱导非脂肪细胞的损伤和凋亡。脂毒性包含了多种应激反应,如内质网应激和氧化应激等。内质网应激通过未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)维持细胞内环境的稳态。但持久强烈的ERS会通过内质网相关性死亡途径(ER-associated death),引起细胞凋亡。肝脏型脂肪酸结合蛋白(liver-type fatty acid binding protein,L-FABP/FABP1)是脂肪酸结合蛋白家族一员,人肾近曲小管上皮细胞表达。尿L-FABP被认为与肾小管间质损伤密切相关,是监测CKD进展的标志物之一。本课题前期研究表明,油酸(Oleic acids,OA)诱导L-FABP表达和ERS,并导致HK-2细胞凋亡。为了进一步探讨L-FABP与ERS之间的关系,本研究比较沉默HK-2细胞L-FABP前后,高PA和OA干预下的HK-2细胞,ERS相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达变化,试图明确L-FABP在FFA通过ERS诱导细胞凋亡中的作用,为临床FFAs引起肾小管细胞凋亡提供实验依据。方法:1实验分组:⑴HK-2细胞随机分为Control,高棕榈酸(PA),高油酸(OA)和高蛋白(Alb)干预组。⑵HK-2细胞分别转染sh NC或sh L-FABP后,分别给予高PA、OA和Alb干预,并设立对照组sh NC、和sh L-FABP。具体实验分组如下。2 MTT法确定HK-2细胞50%生存率的PA浓度;3 Western blot法确定PA、OA干预HK-2细胞时间;4观察PA、OA和Alb干预对L-FABP、HK-2细胞内质网应激相关蛋白及凋亡蛋白表达的影响;5观察转染sh L-FABP质粒后,PA、OA和Alb干预对HK-2细胞中的L-FABP、内质网应激相关蛋白及凋亡蛋白表达的影响。结果:1确定PA对HK-2细胞的干预浓度不同浓度PA干预HK-2细胞24h,发现PA浓度为200μmol/L HK-2细胞生存率为40%,接近50%。故选取PA浓度200μmol/L为干预浓度。2 PA干预HK-2细胞L-FABP的表达变化PA分别干预HK-2细胞3h,6h,12h,24h和48h的结果显示:与干预前比较,3h,6h和12h L-FABP蛋白表达无明显变化,24h表达达到峰值,48h表达减少。3 OA干预HK-2细胞L-FABP的表达变化OA分别干预HK-2细胞3h,6h,12h,24h和48h的结果显示:与干预前比较,12h,24h和48h L-FABP蛋白表达增加,但24h达到峰值。4 PA、OA和Alb干预对HK-2细胞L-FABP蛋白表达的影响OA组和PA组L-FABP表达均高于正常对照组,Alb组与Control组无明显区别。5 PA、OA和Alb干预对HK-2细胞内质网应激相关蛋白及凋亡蛋白表达的影响OA组和PA组内质网应激相关蛋白和凋亡相关GRP78、CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3的表达均高于Control组;Alb组与Control组无明显区别。6 sh L-FABP质粒下调HK-2细胞中的L-FABP蛋白表达水平。荧光结果显示,sh NC组和sh L-FABP组均可捕获质粒所携带的绿色荧光。与Control组相比,sh L-FABP组HK-2细胞的L-FABP蛋白的表达水平明显降低。7 sh L-FABP质粒下调PA和OA诱导的HK-2细胞内质网应激相关蛋白的高表达。⑴PA+sh NC组与sh NC组相比较,GRP78、PERK和p-PERK蛋白的表达水平明显增高。敲低L-FABP后,PA+sh L-FABP组与PA+sh NC组相比较,GRP78、PERK、p-PERK蛋白的表达水平明显降低。⑵OA+sh NC组与sh NC组相比较,GRP78、PERK和p-PERK蛋白的表达水平明显增高。敲低L-FABP后,OA+sh L-FABP组与OA+sh NC组相比较,GRP78、PERK、p-PERK蛋白的表达水平明显降低。⑶Alb+sh NC组与sh NC组相比较,PERK蛋白的表达水平有所增高,GRP78和p-PERK蛋白的表达水平无明显变化。敲低L-FABP后,Alb+sh L-FABP组与Alb+sh NC组相比较,PERK和p-PERK蛋白的表达水平有所下降,GRP78蛋白的表达水平无明显变化。8 sh L-FABP质粒下调PA和OA诱导HK-2细胞内质网相关凋亡蛋白的高表达。⑴PA+sh NC组与sh NC组相比较,CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3蛋白的表达水平明显增高。敲低L-FABP后,PA+sh L-FABP组与PA+sh NC组相比较,CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3蛋白的表达水平明显下调。⑵OA+sh NC组与sh NC组相比较,CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3蛋白的表达水平明显增高。敲低L-FABP后,OA+sh L-FABP组与OA+sh NC组相比较,CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3蛋白的表达水平明显下调。⑶Alb+sh NC组与sh NC组相比较CHOP、Caspase3和CleaveCaspase3蛋白的表达水平无明显增高。敲低L-FABP后,Alb+sh L-FABP组与Alb+sh NC组相比较,CHOP、Caspase3蛋白的表达水平无明显下调,Cleave Caspase3蛋白表达水平有所下调。结论:1 PA和OA上调HK-2细胞L-FABP蛋白,ERS相关蛋白以及ER相关凋亡蛋白表达,这一结果证实OA和PA可诱导L-FABP蛋白表达,ERS和ER相关的凋亡的发生。2沉默HK-2细胞的L-FABP,PA和OA干预上调的ERS相关蛋白以及ER相关凋亡蛋白有意义降低,证实L-FABP参与了FFAs诱导的ERS,并最终激活细胞ERS相关凋亡的发生。3高蛋白干预不能上调HK-2细胞L-FABP的表达;无论L-FABP沉默与否,与对照组比较,高蛋白干预也不上调ERS相关蛋白以及ER相关凋亡蛋白的表达,在细胞学水平证实蛋白尿中导致肾小管上皮细胞损伤和凋亡的主要成份是FFAs而不是白蛋白。