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自然条件下,植物经常会遭受干旱、低温和盐碱等逆境胁迫,使其生存能力、作物的产量、生长量、发育情况、光合速率或矿质元素吸收速率等受到抑制甚至导致植株的死亡。各种环境胁迫造成的危害已经成为实现可持续发展的重要限制因素。研究抗逆相关基因的功能,了解植物的适应和驯化的生理机制以及逆境伤害机制是基因工程抗性育种的重要前提。bHLH (basic/helix-loop-helix,碱性螺旋-环-螺旋)转录因子是一类含有众多成员的重要转录因子,该结构域具有与DNA结合和与bHLH蛋白形成同源或异源二聚体的能力,在植物和动物中都有十分重要的转录调控作用。但植物中对该家族的研究还比较少,其具体的生物学功能目前尚不清楚。已有的研究表明,bHLH基因参与植物细胞的诸多生命活动,并参与植物的抗逆反应。为研究bHLH基因的功能,本研究对来自香杨的bHLH基因的表达和功能进行了初步研究。应用同源序列克隆的方法从香杨cDNA文库中克隆到一条bHLH基因,获得bHLH基因的全长序列986 bp,命名为PkbHLHo该基因开放阅读框全长894 bp,共编码297个氨基酸,该基因编码蛋白的分子量为35.46 kDa,理论等电点为6.60。多序列比对分析表明,香杨bHLH与其它植物bHLH蛋白的同源性较低。利用同源序列克隆方法,克隆得到长度为1741 bp的bHLH启动子。序列分析表明,该启动子区包含多种与逆境响应相关的顺式作用元件,如ABRE、W-box、MYB、ARRIAT、GATABOX等。将bHLH启动子构建到pBI121质粒中,使其驱动GUS表达,将重组质粒导入农杆菌中,用农杆菌介导法瞬时转化烟草,GUS染色显示表明该启动子具有启动表达的活性。利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥及烟草,通过对种子的卡那霉素抗性筛选获得转化拟南芥,GUS染色结果表明,bHLH基因主要在茎部表达,在叶片中也有少量表达,转化烟草也得到了相同的结果。为研究bHLH表达的分子机制,首先构建了香杨cDNA文库,并将bHLH启动子构建到报告载体pHIS2中,共转化到酵母中,利用酵母单杂交系统筛选香杨cDNA文库中bHLH基因的上游调控基因。共筛选到6个可能与bHLH互作的基因,分别是蛋白磷酸酶、细胞壁相关水解酶、乙醇酸氧化酶、光系统Ⅱ蛋白D1、假定蛋白等。选择bHLH启动子中与逆境响应相关的顺式作用元件ABRELATERD1 (ACGTG),将其序列以3次串联重复的形式构建到报告载体pHIS2中,利用酵母单杂交系统验证该元件与其上游调控基因ABRE的互作,并对ABRE蛋白与顺式作用元件ABRELATERD1的互作进行了验证。结果显示顺式作用元件ABRELATERD1能与其上游调控基因ABRE互作,提示该基因可能调控了bHLH基因的表达。