植物病原菌的种群格局是各种历史和当前的寄主与生态环境在不同空间尺度共同作用的结果,弄清病原菌群体的遗传结构可以更好地诠释该病害在自然群体中的流行规律。水稻纹枯病和稻瘟病是世界流行性真菌病害,对水稻产量和粮食安全构成极大威胁。深入解析水稻纹枯病菌和稻瘟病菌的遗传结构,有助于阐明其在农业生态系统中的起源、进化及传播特征。本研究在前期调查的基础上,采用分子系统地理学的方法对中国南方稻区水稻纹枯病菌和稻瘟病菌群体遗传变异进行评估,结合SSR标记和核糖体DNA序列的数据揭示各个病原菌的系统地理格局,探讨历史事件、生态因素和病原菌习性对其地理群体遗传结构的影响,了解病原菌在农业生态系统中的演变历程和进化潜力,为针对这两个病害制定有效的防治策略提供参考依据。具体研究内容如下：1、水稻纹枯病菌微卫星标记的开发根据生物素与链亲和素的强亲和性原理,用限制性内切酶Sau3AI消化水稻纹枯病菌基因组DNA,回收纯化400-900 bp的片段,连接人工接头,与生物素标记的寡核苷酸探针(AC)12、(TCG)8、(GTC)8和(GCT)8退火结合后,用链亲和素磁珠亲和捕捉,获得含有微卫星序列的单链目的片段,经PCR扩增形成双链后,克隆到pMD18-T载体上,转化至DH5α中,构建了4个水稻纹枯病菌微卫星富集文库。从文库中随机抽取500个克隆进行测序,共获得含微卫星的序列66个,其阳性克隆率达13.2%。用50个水稻纹枯病菌对微卫星位点进行检测,经筛选获得了8对多态性的微卫星基因座(GenBank登陆号：KM249342- KM249349),每个位点的等位基因数在3到9个之间,观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)平均值分别为0.06-0.74和0.15-0.72,Shannon’s多样性指数平均值为0.33-1.58,结果表明这些微卫星标记可以用于水稻纹枯病菌群体遗传多样性的研究。2、基于SSR标记的中国南方水稻纹枯病菌群体遗传结构分析利用16对SSR荧光标记对收集自中国南方8省(自治区)238个水稻纹枯病菌进行分析,共计检测出144个等位基因,平均每个位点的观测等位基因数(Na)为4.768,有效等位基因数(Ne)为2.309。10个水稻纹枯病菌群体的Shannon’s信息指数(I)为0.986。等位基因丰富度(AR)为4.272,观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.523和0.518。总群体水平的近交系数(FIS=-0.012)为负值,表明总群体内杂合子过剩(纯合子缺失)。Hardy-Weinberg平衡检验表明,在9个群体中存在因杂合子的缺失或过剩引起的平衡偏离,暗示了水稻纹枯病菌同时具有克隆生长和有性繁殖,两种繁殖方式间的平衡因群体而异。分子方差分析显示,有89.50%的遗传变异来自群体内部的个体间,表明遗传变异主要发生在群体内。同一地区不同年份群体之间的遗传多样性极为相似。Mantel检测发现,遗传距离与其地理距离之间呈显著正相关(r=0.418,P=0.026)。Structure结果表明,所有群体可被划分为遗传分化明显的两个亚群,其中位于珠江沿岸的广宁和长塘群体为一个组群,而位于长江沿岸的7个群体为另一组群；位于长江沿岸的群体遗传混杂明显,基因交流水平高(Nm=1.021-10.861),在一定程度上阻止了群体间分化,而表现出较低的遗传分化(FST=0.023-0.218)。基于水稻纹枯病菌群体的遗传结构,推测病原菌有限的长距离迁移及其可能的混合繁殖模式可能是群体遗传变异空间结构形成的主要原因,说明水稻纹枯病菌在该地区具有中等-高等水平的进化潜能,这使得病害的防治难度加大。因此,对水稻纹枯病菌的防治,除了施用化学药剂和种植抗性品种外,还需要防治农田灌水引起的病原菌在地区间的流动传播,减少带菌种子迁移或农用机械的交叉污染,并对寄主作物的种子播前进行灭菌处理等。3、中国南方水稻纹枯病菌群体致病力分化的研究以抗感反应不同的5个水稻品种为材料,用温室苗期接种鉴定法,对从中国南方采集的238个水稻纹枯病菌进行致病性鉴定。结果表明,不同菌株间致病力存在明显差异,在5个鉴别品种上的病情指数呈正态分布。基于5个鉴别品种的平均病情指数的动态聚类分析,将所有菌株划分为弱、中、强3种致病型,分别占供试菌株的24.37%、50.0%和25.63%,其中中等致病型菌株占优势。采用Bayes法建立了各致病型的判别函数,判别准确率达96.00%,说明采用聚类判别分析能够对水稻纹枯病菌致病力的分化进行合理的判断。各致病型在不同的地域或年份间呈随机分布,表明自然条件下水稻纹枯病菌为混合致病群,菌株的致病力差异与菌株地域来源与采集年份无明显相关。4、基于ITS序列分析的中国南方水稻纹枯病菌群体遗传结构的研究采用ITS-5.8S rDNA测序技术,分析了收集自中国南方7省(自治区)的173个水稻纹枯病菌的遗传变异。根据ITS序列的核苷酸变异共检测到52种单倍型,其中单倍型H4和H7为7个群体的共享单倍型,占样本总数的57.80%,为群体间存在基因交流提供了分子证据。水稻纹枯病菌群体的单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.804和0.402%。群体间的遗传分化系数(FST)为0.026-0.433,基因流(Nm)为0.327-9.329。分子方差分析显示,群体间的遗传变异仅占总变异的10.46%,而89.54%的变异存在于群体内。单倍型间的系统发育树表明,不同地点的单倍型混合分布。中性检验和单倍型的网状图均显示,水稻纹枯病菌群体在历史上曾经历种群暴发而不断扩散,因还未能获得足够的时间建立更加复杂的结构故而呈辐射状分布。UPGMA聚类表明,所有群体可被划分为遗传分化明显的两个亚群,其中位于珠江沿岸的群体为一个组群,而位于长江沿岸的群体为另一组群,这与SSR分析的遗传结构结果一致。5、基于SSR标记的中国南方稻瘟病菌群体遗传结构的研究利用8对SSR荧光标记对中国南方7省(自治区)的250个稻瘟病菌进行分析,共计检测出114个等位基因,平均每个位点的观测等位基因数(Na)为4.96,有效等位基因数(Ne)为2.57。10个稻瘟病菌群体的Shannon’s信息指数(I)为0.99,等位基因丰富度(AR)为4.265,表明稻瘟病菌群体具有较高的遗传多样性。总群体的平均观测杂合度(Ho=0.39)低于期望杂合度(He=0.51),暗示群体内存在因近交而导致的杂合子缺失。Hardy-Weinberg平衡检验表明,在8个群体中存在因杂合子的缺失引起的平衡偏离,群体表现出明显的有性繁殖方式。分子方差分析显示,绝大多数遗传变异(75.98%)存在于群体内,仅有24.02%的变异来自于群体间,说明病原菌群体间低水平分化而群体内高水平变异。地理群体间呈现不同程度的遗传分化(FST=0.09-0.578)。Mantel检验表明,群体间的遗传距离与地理距离呈正相关(r=0.396；P=0.041)。来自同一地区不同年份的群体间表现出低的遗传分化(FST<0.05),表明年份间稻瘟病菌群体虽有局部的变化,但整体遗传多样性保持稳定。基于贝叶斯聚类法的Structure分析表明,10个群体间存在不同程度的基因流或病原菌的传播(Nm=0.182-2.529),部分群体间的基因流相对较弱,说明基因流的阻断可能是导致遗传分化的主要原因；部分群体间存在广泛的菌源交流,说明在对稻瘟病进行防治时,要尽量减少不同地区间带菌种子的污染。6、中国南方稻瘟病菌群体致病力变异研究用7个中国鉴别品种对中国南方72个稻瘟病菌的毒性结构进行鉴定,结果表明,中国南方稻瘟病菌群体具有较丰富的毒性类型,测定出ZA、ZB、ZC、ZD、ZEZG 6群38个生理小种。优势种群为籼型小种ZA和ZB,出现频率分别为45.83%和37.5%,优势生理小种为ZA1、ZB15和ZB17,说明稻瘟病菌受南方种植水稻品种的选择作用较为明显。基于7个稻瘟病菌无毒基因(ACE1、Avr-CO39、Avr-Pib、Avr-Pik、Avr-Pita、Avr-Piz-t和PWL2)的序列,对201个稻瘟病菌进行检测,发现PWL2基因分布频率最高(100%),其次为Avr-Pib基因(98.51%),Avr-Pita(42.79%)分布频率最低。各无毒基因在不同地区均有分布,但出现频率不同。中国南方稻瘟病菌群体致病型多样性显示了生态环境和抗病品种对病原菌的强烈选择作用。值得一提的是,稻瘟病菌的这个流行学特征,使其能够在缺乏有性重组的情况下,也能因在寄主抗性与病原菌毒性相互作用的共进化过程中带有更多的遗传变异。