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造血干细胞是不可或缺的,它为整个生命体提供不同阶段、所有类型的血细胞。造血干细胞的发育起源,包括位点、时间、调控机制等,长期以来广受关注。众所周知,AGM区是小鼠胚内唯一的造血干细胞发生位点。然而,既往研究发现去除AGM区之外的胚胎体细胞仍然能够重建成年受体的造血系统,提示胚内可能还存在其他未知的造血位点。本研究拟通过多种手段明确小鼠胚胎头部的造血干细胞潜能和命运。我们通过体内移植实验发现：E10.5时,移植1.7-2.5个胚胎量的AGM区细胞,大约30%(14/40)的受体长期重建(>16周),嵌合率46.6%±22.4%。而移植头部细胞,12%(5/40)的受体长期重建,嵌合率57.2%±22.9%。但移植循环血细胞后,均未检测到嵌合阳性信号。E11.5时,头部细胞移植后,40%(8/20)的受体长期重建,嵌合率54.6%±23.8%,而AGM区60%(9/15)受体长期重建,嵌合率47.9%±20.9%。同时,通过各系嵌合以及二次移植明确E10.5和E11.5的头部含有真正的造血干细胞,能多向分化和自我更新。通过流式分选后移植,发现头部造血干细胞富集于CD34+c-Kit+细胞群。我们利用流式技术对E9.5-E11.5小鼠胚胎头部和AGM区进行分析,发现均含有相当比例的CD34+c-Kit、CD41+c-Kit、CD45+c-Kit+细胞。同时,我们也利用实时定量PCR检测造血、内皮相关基因的表达,发现E10.5头部的Scl、P2-Runx1、 GATA2的转录水平是相应AGM区的1.5、1.6、2.3倍,而Tie2、CD144表达水平相当。在Tie2+以及CD31+c-Kit+细胞群中,无论E10.5还是E11.5,头部细胞Scl、P2-Runxl、GATA2的表达水平均与AGM类似。继而,我们通过原位染色、流式分析、纯化内皮细胞体外诱导和内皮细胞命运示踪考察小鼠胚胎头部的内皮细胞是否具有生血潜能。首先我们采用免疫组化染色发现E10.5的头部紧贴动脉内皮层有CD31+的造血样细胞,或成簇或散在。通过流式分析发现,E10.5头部的CD31+c-Kithigh比例为0.063%-0.113%,稍低于AGM区(0.088%-0.157%)。其次,通过流式分选获得头部内皮细胞(CD31+CD41-CD45-Ter119-),与OP9共培养后可产生CD45+的造血细胞和CD19+的B细胞,与AGM相似。应用可诱导的VE-cadherin-Cre;tdTomato小鼠模型发现,头部细胞产生的一些造血簇共表达红色荧光蛋白和CD45,即tdTomato+CD45+,表明内皮生血活动的发生,与AGM区类似。流式分析确认tdTomato+细胞中的大部分为CD45+。相反,该现象在循环血细胞并未发现。SP-A-Cre转基因小鼠模型可特异性标记脑组织而非其它位点的血管内皮细胞,适合用于追踪脑血管内皮细胞的造血命运。首先我们将E12.5的sP-A-Cre;ROSA-LacZ小鼠胚胎进行LacZ染色,相应的头部切片中,发现在动脉内皮层和动脉管腔内的造血细胞有LacZ阳性信号,一些LacZ阳性的血细胞可能是通过出芽的方式由内皮细胞层产生。类似的阳性信号在AGM区和胎肝中并未发现。我们也通过原代细胞的流式分析和体外诱导考察SP-A-Cre;ROSA-LacZ胚胎头部细胞的造血能力。E13.5的AP-A-Cre;ROSA-LacZ头部CD31+内皮细胞中,10.5%为FDG+,而CD45+的造血细胞中,4.6%为FDG+。头部的Tie2+细胞与OP9共培养之后,CD31+内皮细胞中20%为FDG+, CD45+造血细胞中8.4%为FDG+,造血祖细胞CD45+c-Kit+中,12.3%为FDG+,B细胞(B220+CD19+)中,27.6%为FDG+。这表明：小鼠胚胎的脑血管内皮细胞具有原位生血和体外造血的能力。最后,我们对不同年龄的SP-A-Cre;ROSA-LacZ.SP-A-cre;ROSSA-EYFP小鼠进行检测以评估脑血管内皮细胞对成体造血系统的生理贡献。我们发现,出生后2周的SP-A-Cre;ROSA.LacZ小鼠的骨髓,富集造血干细胞的LSK(Lin-Sca-1+c-Kit+)亚群中,LacZ阳性的细胞比例较低,1.1%-1.3%。4周龄小鼠的骨髓中,在富集造血干细胞效率更高的亚群,即LSKCD48-CD150+, LacZ阳性细胞的比例为4.2%-4.5%。我们也考察了4-6周龄的SP-A-Cre;ROSA-EYFP小鼠造血各系的情况,发现骨髓的LSKCD48’CD150+细胞中,EYFP阳性细胞的比例为5.9%-7.7%。骨髓和外周血各系均有更高比例的EYFP阳性细胞。上述命运示踪的结果进一步明确了脑血管内皮细胞对血液系统的生理性贡献。总之,我们通过检测小鼠胚胎头部的造血干细胞功能,考察脑血管内皮细胞的生血潜能,以及评估脑血管内皮细胞对胚胎和成体造血系统的生理贡献,在国际上首次揭示小鼠胚胎头部是一个新的的造血干细胞发育位点。新的生血位点的发现,有望进一步明晰血管内皮细胞选择造血干细胞命运的关键调控信号,为造血系统的再生提供新思路和新策略。