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炎症性牙根吸收（inflammatory root resorption IRR）是一种在炎症环境下,牙根吸收量大于牙根修复量的病理过程。严重的炎症性牙根吸收可能造成牙齿脱落。临床中发现牙周炎、根尖周炎以及不恰当的正畸治疗都可能诱发炎症性牙根吸收,但其内在的发生机制和预防方式尚未研究清楚。成牙骨质细胞位于牙骨质的表面,可以通过调控破骨成骨相关基因的表达,促进或抑制牙根吸收;也能够形成牙骨质对牙根吸陷窝区域进行修复。Chemerin是一种新发现的趋化蛋白,通过与ChemR23结合发挥功能,不仅在巨噬细胞和树突状细胞向炎症部位的迁移中发挥重要作用,还在诱导破骨细胞的分化形成上扮演关键角色。有研究发现,炎症因子能够影响成牙骨质细胞的分化矿化能力。据此,Chemerin是否调控成牙骨质细胞炎症因子的分泌进而影响其功能,从而影响炎症性牙根吸收的发生,目前未见相关报道。本实验旨在于探索Chemerin/ChemR23在成牙骨质细胞功能和炎症性牙根吸收中发挥的作用,以期为炎症性牙根吸收发生机制提供新证据,为临床治疗提供新靶点。本实验分为体外和体内两个部分:实验一:Chemerin对成牙骨质细胞功能的影响及内在机制研究第一部分Chemerin/ChemR23对成牙骨质细胞功能的影响目的:通过体外Chemerin刺激成牙骨质细胞OCCM-30,探究Chemerin对成牙骨质细胞功能的影响。方法:首先用25 ng/ml Chemerin刺激OCCM-30细胞12 h、24 h和48 h,运用CCK-8比色法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞的凋亡水平,RT-PCR检测细胞OPG、RANKL、Cathepsin K和Runx2m RNA的表达,以及Western blot检测cleaved-caspase3、Cathepsin K和Runx2蛋白水平。其次,在25 ng/ml Chemerin刺激OCCM-30之前,用小干扰RNA技术转染使得ChemR23受体表达降低,同时采用RT-PCR技术检测细胞OPG、RANKL、Runx2、Osterix、BSP、OCN基因的表达,Western blot检测Cathepsin K、Runx2、cleaved-caspase3蛋白表达的变化。结果:25 ng/ml Chemerin作用OCCM-30后,CCK-8结果显示当Chemerin作用于成牙骨质细胞12 h时,其增殖能力明显下降。流式细胞仪显示,随着Chemerin作用时间变长,细胞凋亡水平增加。在Chemerin处理细胞24 h后,其RANKL、Cathepsin K m RNA表达明显增加,OPG和Runx2 m RNA表达明显下降,差异皆具有统计学意义（P<0.05）。同时cleaved-caspase3、Cathepsin K蛋白水平随着Chemerin作用时间增加而增加,Runx2蛋白水平随着在Chemerin作用时间增加而降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。在25 ng/ml Chemerin刺激下,当ChemR23受体被沉默之后,相较于空白组,细胞OPG、Runx2、Osterix、BSP和OCN m RNA表达增加,RANKL m RNA表达降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。同时cleaved-caspase3、Cathepsin K蛋白水平随着ChemR23表达降低而降低,Runx2蛋白水平变化则与之相反。结论:Chemerin通过与ChemR23结合促进成牙骨质细胞的凋亡、破骨相关基因的表达以及抑制成牙骨质细胞分化矿化能力。第二部分炎症因子和相关信号通路在Chemerin/ChemR23调控成牙骨质细胞功能中所起作用目的:探究在Chemerin/ChemR23调控成牙骨质细胞功能的过程中炎症因子和P38、Erk1/2 MAPK以及Akt信号通路在其中的作用。方法:首先使用10/25/50 ng/ml Chemerin刺激成牙骨质细胞24 h,RT-PCR和Elisa检测成牙骨质细胞炎症因子TNF-α和IL-6的表达。其次,在25 ng/ml Chemerin刺激成牙骨质细胞的同时将ChemR23受体沉默。采用RT-PCR技术和Elisa试剂盒检测成牙骨质细胞TNF-α和IL-6表达水平,Western blot检测磷酸化P38、P38、磷酸化Erk1/2、Erk1/2、磷酸化P13K-Akt以及P13K-Akt蛋白表达的变化。最后,使用P38、Erk1/2 MAPK以及Akt特异性抑制剂预处理成牙骨质细胞1h后,再在25 ng/ml Chemerin刺激下培养24 h,通过Elisa检测成牙骨质细胞TNF-α和IL-6表达水平,Western blot检测Cathepsin K、Runx2、cleaved-caspase3蛋白水平。结果:RT-PCR和Elisa结果显示,随着Chemerin刺激浓度增加,成牙骨质细胞炎症因子TNF-α和IL-6表达增加。在25 ng/ml Chemerin刺激下,当ChemR23受体被沉默之后,相较于空白组,成牙骨质细胞TNF-α和IL-6表达降低。在Chemerin的作用下,成牙骨质细胞内磷酸化P38、磷酸化Erk1/2、Erk1/2、磷酸化P13K-Akt蛋白水平表达增加,总P38、Erk1/2以及P13K-Akt蛋白水平无明显差异。在使用P38、Erk1/2以及P13K-Akt特异性抑制剂后,Elisa和RT-PCR结果显示抑制剂PD98059、SB203580和LY294002都可以逆转Chemerin导致的成牙骨质细胞炎症因子表达增多的效应。Western blot结果显示抑制剂PD98059、SB203580和LY294002可以逆转Chemerin造成的Runx2蛋白抑制性表达。与抑制剂PD98059和LY294002相比,SB203580明显降低了Cathspsin K蛋白的表达。同时,抑制剂PD98059、SB203580也都明显降低了cleaved-caspase3蛋白的表达。结论:Chemerin/ChemR23通过Erk1/2,P38 MAPK和Akt信号通路调控炎症因子的表达,进而影响成牙骨质细胞功能。实验二:Chemerin/ChemR23对炎症性牙根吸收的影响目的:通过构建炎症性牙根吸收体内模型,验证Chemerin/ChemR23促进炎症性牙根吸收发生的观点。方法:选取6只野生型小鼠和12只Chemerin过表达小鼠,通过向小鼠左侧第一磨牙施加50 g的应力建立炎症性牙根吸收模型,其中6只Chemerin过表达小鼠左侧第一磨牙牙周膜内需要每天注射ChemR23受体拮抗剂。所有的小鼠分为三组:野生型小鼠、Chemerin过表达小鼠、进行ChemR23拮抗剂注射的Chemerin过表达小鼠,在进行实验结果统计分析时,分为四个小组:野生型未加力组、野生型加力组、Chemerin过表达小鼠加力组、Chemerin过表达小鼠加力并进行ChemR23拮抗剂注射组。应力加载7天后,将小鼠处死。采用Micro-CT扫描小鼠第一磨牙牙根,数据导入Mimics对牙根吸收陷窝进行测量分析。将小鼠第一磨牙牙根标本制成石蜡切片进行TNF-α、IL-6、Cathepsin K和Runx2的免疫组化染色。结果:Micro-CT数据显示,在野生型未加力组、野生型加力组、Chemerin过表达小鼠加力组、Chemerin过表达小鼠加力并进行ChemR23拮抗剂注射组这四组中,Chemerin过表达加力组牙根吸收陷窝体积最大,差异具有统计学意义（P<0.05）。当ChemR23表达降低后,牙根吸收陷窝体积也随之降低。免疫组化结果显示,相较于野生型未加力组,野生型加力组小鼠牙周组织中TNF-α、IL-6和Cathepsin K表达都增加,而Chemerin过表达小鼠加力组牙周组织TNF-α、IL-6和Cathepsin K表达则更高,Runx2表达水平在所有组中最低。当下调ChemR23的表达后,牙周组织中TNF-α、IL-6、Cathepsin K和Runx2表达情况被逆转。结论:Chemerin/ChemR23促进炎症性牙根吸收的发生,这可能与炎症因子TNF-α、IL-6的表达增加密切相关。