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牙周炎是口腔常见的一种疾病,也是造成牙齿缺失的第一大原因,主要是由牙周致病菌繁殖及代谢释放毒素引起的牙周软组织的炎症及骨组织降解破坏,并刺激机体进一步产生免疫应答促进组织破坏的疾病。 脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是革兰阴性菌细胞壁的主要成分,也是诱发炎症的主要因素,其与牙周病的发生发展关系现已相对明确。然而近年来有体内、体外研究表明LPS会刺激巨噬细胞中高迁移率族蛋白1(High Mobility Group Box-1,HMGB1)的合成、转位及释放,提示HMGB1可作为LPS的下游因子,在LPS引起的相关病变中继发性地影响疾病进程。那么,HMGB1是否参与牙周炎的进展以及它在其中发挥的作用是什么？尚有很多需要探索的地方。 本研究旨在探究LPS及其下游因子HMGB1如何通过影响巨噬细胞的极化分型及破骨前体细胞的极化相关基因的表达情况,从而影响牙周炎性疾病的发生发展进程,以期为牙周炎的治疗提供新的思路。 第一章 牙周炎患者龈沟液中HMGB1、IL-6、TNF-α的表达情况 目的： 以往大量文献已明确LPS与牙周炎的关系。最近体外研究表明高迁移率族蛋白HMGB1可在LPS的刺激下由巨噬细胞产生,在炎症中可作为致炎因子,也可促进破骨分化及骨吸收活性,提示了LPS与HMGB1之间的联系。但是HMGB1是否在牙周炎中起作用？ 本实验通过临床收集牙周炎病人龈沟液样本进行成分检测,探究牙周炎患者牙周组织渗出物的特征。检测龈沟液中HMGB1蛋白表达量,从临床方面探究HMGB1与牙周疾病的关系。同时检测龈沟液中与巨噬细胞、破骨前体细胞M1型极化相关的细胞因子TNF-α、IL-6的蛋白表达量,从蛋白质层面探究M1型极化与牙周炎症的关系。 方法： 1.于2017年南方医科大学口腔医院牙周科的就诊患者中,根据慢性牙周炎诊断标准选取慢性牙周炎患者10例作为实验组,中度、重度者各5例。同时于牙体牙髓科选取牙周健康者10例作为对照组。 2.进行全身情况的问诊以及系统性牙周检查。 3.用层析滤纸轻插入待测牙颊侧龈沟内约1mm,停留30s。 结果： 1.龈沟液样本中HMGB1蛋白表达量: 在牙周健康的对照组龈沟液样本中,HMGB1平均蛋白表达量6.76ng/ml。在慢性牙周炎的实验组龈沟液样本中,HMGB1蛋白表达量15.71ng/ml。 中度牙周炎组龈沟样品中,HMGB1蛋白平均表达量为12.97ng/ml。重度牙周炎龈沟液中HMGB1平均表达量为18.44ng/ml。 2.龈沟液样本中IL-6蛋白表达量: 在牙周健康的对照组龈沟液样本中,IL-6平均蛋白表达量0.11ng/ml。在慢性牙周炎的实验组龈沟液样本中,IL-6蛋白表达量1.40ng/ml 中度牙周炎组龈沟样品中,IL-6蛋白平均表达量为0.78ng/ml。重度牙周炎龈沟液中IL-6平均表达量为2.02ng/ml 结论： 1.龈沟液样本中HMGB1蛋白表达量:慢性牙周炎组的HMGB1表达量明显高于正常对照组(P＜0.01)。重度牙周炎组龈沟液中HMGB1的平均蛋白表达量明显高于中度牙周炎组(P＜0.01)。 2.龈沟液样本中IL-6蛋白表达量:慢性牙周炎组的IL-6表达量明显高于正常对照组(P＜0.01)。重度牙周炎组龈沟液中IL-6的平均蛋白表达量高于中度牙周炎组(P＞0.05)。 第二章 细菌脂多糖对小鼠巨噬细胞系RAW264.7及RAW264.7破骨前体细胞极化分型相关基因表达的影响 目的： LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分,也是诱发牙周炎症的主要成分。牙周炎病理机制中,巨噬细胞及破骨前体细胞作为主要的效应细胞参与到牙周病的病理过程中,由于其在牙周炎中发挥重要的作用,其不同分型对疾病走向有重要影响。 有关LPS和牙周炎关系的研究很多,但其对巨噬细胞,特别是对破骨前体细胞作用的研究尚不多,对此展开研究有助于加深对牙周炎的病理机制的理解。本实验旨在通过研究LPS对巨噬细胞的极化分型及对破骨前体细胞的相关极化基因表达情况的影响,探讨其在牙周炎性疾病中的作用机制。 方法： 1.小鼠巨噬细胞系RAW264.7培养于含有10％胎牛血清、100U/m1青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中。置于37℃,5％二氧化碳培养箱中贴壁生长。每2～3d更换培养液。 2.用含有100ng/ml核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL)、1％巨噬细胞集落刺激因子(macrophages colony stimulating factor,MCSF)的完全培养基诱导3d,使巨噬细胞分化成为RAW264.7破骨前体细胞,镜下观察形态。 结果： LPS(Pg)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7M1/M2极化分型相关基因的影响: LPS(Pg)干预实验组M1的相关指标明显上调,M2的相关指标无明显变化。 M1相关指标:NOS2基因表达较对照组上调19.34倍(P＜0.01);IL-6基因表达较对照组上调61.78倍(P＜0.01);TNF-α基因表达较对照组上调2.12倍(P＜0.01)。 M2相关指标:ARG-1基因表达下调为对照组的67％(P＞0.05);RELM-α基因表达下调为对照组的42％(P＞0.05)。 结论： 外源性的LPS(Pg)刺激使RAW264.7巨噬细胞系及RAW264.7破骨前体细胞M1极化分型相关基因表达增加,促进炎症破坏的进展。 第三章 高迁移率族蛋白1对小鼠巨噬细胞系RAW264.7及RAW264.7破骨前体细胞极化分型相关基因表达的影响 目的： 在第一章研究中提示HMGB1参与到牙周炎进程中,在第二章研究中发现LPS可促进巨噬细胞M1方向的极化及破骨前体细胞M1相关极化基因的表达。 近年来有研究表明LPS能诱导巨噬细胞内HMGB1的合成、转位及释放。说明HMGB1可作为LPS的下游因子,在LPS引起的相关病变中继发性地影响疾病进程。那么,在LPS导致牙周炎骨破坏的过程中,HMGB1是否参与其中？是否会对巨噬细胞及破骨前体细胞产生类似LPS的作用？本实验旨在进一步探究在这一信号通路中HMGB1如何通过影响巨噬细胞的极化分型及破骨前体细胞的相关极化基因表达水平来影响牙周疾病的进程。 方法： 1.小鼠巨噬细胞系RAW264.7培养于含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中。置于37℃,5％二氧化碳培养箱中贴壁生长。每2～3d更换培养液。 2.用含有100ng/mlRANKL、1％MCSF的完全培养基诱导3d,使巨噬细胞分化成为RAW264.7破骨前体细胞,镜下观察形态。 3.待RAW264.7巨噬细胞及破骨前体细胞生长至80％时,用HMGB11μg/ml刺激18h,阴性对照以DMEM培养基培养。 结果： 1.HMGB1刺激下RAW264.7巨噬细胞M1/M2相关极化基因表达情况: HMGB1刺激过后的破骨细胞前体细胞,M1及M2的相关指标表达均上调。 M1相关指标:NOS2基因表达较对照组上调4.02倍(P＜0.01);IL-6基因表达较对照组上调2.50倍(P＞0.05);TNF-α基因表达较对照组上调1.29倍(P＜0.01)。 M2相关指标:ARG-1基因表达较对照组上调1.25倍(P＞0.05);RELM-α基因表达较对照组上调13.61倍(P＜0.01)。 2.HMGB1刺激下RAW264.7破骨前体细胞M1/M2相关极化基因表达情况: HMGB1刺激过后的巨噬细胞,M1相关指标无明显变化,M2的相关指标表达明显上调。 M1相关指标:NOS2基因表达下调为对照组的80％(P＜0.05);IL-6基因表达较对照组上调1.22倍(P＞0.05);TNF-α基因表达较对照组上调1.04倍(P＞0.05);IL-1基因表达下调为对照组的81％(P＞0.05);CXCL-11至基因表达下调为对照组的94％(P＞0.05)。 M2相关指标:ARG-1基因表达较对照组上调2.42倍(P＜0.05);RELM-α基因表达较对照组上调3.52倍（P＜0.01）。MRC-1基因表达较对照组上调7.28倍(P＜0.01)。 结论： HMGB1的刺激下,RAW264.7巨噬细胞向M1和M2两个方向的极化都显著增加。而在破骨前体细胞阶段,HMGB1的刺激对M1极化分型相关基因的表达水平没有明显作用,而对M2极化分型相关基因的表达有明显的促进效应,可起到负反馈调节作用,促进组织修复。