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肝纤维化（hepatic fibrosis）是各种致病因子引起慢性肝病，进而发展为肝硬化的一个动态过程与共同病理途径。其主要病理改变是细胞外间质（extracellular matrix，ECM）的过度合成与异常沉积，肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是参与该过程的最重要细胞，它的激活导致自身增殖和胶原合成增加，而肝纤维化恢复期HSCs凋亡明显增多。所以，HSCs增殖和凋亡在肝纤维化的形成和逆转过程中起关键作用，被认为是各种肝脏损伤引起肝纤维化的中心环节。 HSCs与ECM之间存在着复杂的相互作用，其相互作用主要经整合素（integrin）介导。基础研究表明，整合素与其相应配基结合后，多个粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）分子聚集在粘着斑（focaladhesion plaque，FAP）处，使FAK N-端区的酪氨酸Tyr397磷酸化而被激活。FAK激活后可能激活多条信号途径，其中比较清楚的是RAS依赖的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）途径。细胞外信号调节激酶1／2(extracellular signal-regulated kinase1（／2），ERK1／2)是MAPK家族中研究得最为清楚的成员，其通路RAS-RAF-MEK-ERK参与细胞多种功能活动。 迄今为止，ECM成分如纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）及整合素在纤维化肝组织与HSCs中的表达及作用已有报道，但整合素活化后的胞内信号途径则知之甚少。为此，我们从HSCs与ECM之间的相互作用着手，以FAK、ERK1／2为切入点，有机结合整体和离体试验，研究整合素信号通路在肝纤维化及HSCs增殖、凋亡中的作用。实验内容主要包括以下四部分： 第一部分，FAK、ERK1在大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达与肝星状细胞增殖，凋亡 中文摘要目的：探讨FAK、ERK；及其wA在实验性大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达及与肝星状细胞增殖、凋亡的关系。方法：采用胆总管结扎Oile duct ligation，BDL)大鼠肝纤维化模型，将80只雄性 Spr卿e Dawlcy大鼠随机分成假手术组与模型组。模型组分别于结扎后Zhr、6hr、Zd、lwk、ZWk、3Wb、4Wb麻醉动物，假手术组与4Wb模型组同批麻醉。采用HE染色、Masson三色染色确定模型建立情况；免疫组织化学及 RTPCR方法研究 F咂、E皿；及其 InRNA在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量的动态变化；应用免疫组织化学方法测定aSMA表达；采用TUNEL及。石MA免疫组织化学双重染色方法了解HSCS凋亡情况。结果：①随着肝纤维化发展，大鼠肝脏中a石MA阳性细胞明显增多，主要分布于汇管区、纤维间隔、肝窦周围及增生的胆管周围细胞，造模l～4wb大鼠肝组织a习MA的阳性面积（ 2．88％士2石3％，22石5％士2．16o，27．45O士l．86％，35．25％士2．34％）均显著高于正常组（5．88％士 l．46％），P＜0．of。②正常肝组织凋亡 HSC siB少，随肝纤维化程度加重，凋亡HSCS也增多。③纤维化肝组织中F肌、E皿；阳性细胞明显增多，主要分布于汇管区、纤维间隔及增生的胆管周围，血管内皮细胞、肝窦周围细胞中也有分布。ERK；在肝细胞也有表达。H者均与a－S帆呈显著正相关，厂值分别为0．963、0．958，P＜0．05。④正常大鼠肝组织中有FAK、ERK；基因表达，分别于造模Zd、6hr开始上调，造模4Wb表达最多。结论：肝纤维化形成过程中HSCs大量活化、增殖，凋亡的HSCS也增多，凋亡机制参与调节HSCs数量的动态平衡；肝纤维化形成过程中FAK、ERKI及其mRNA表达明显增加，FAK、ERKI表达增加在HSCS增殖及肝纤维化形成与发展中起一定作用。第二部分：槽甘－天冬丝氨臼四聊肝星状细胞增植、凋亡的影响目的：探讨精－甘－天冬－丝氨酸（RGDS）四肽对纤维粘连蛋白（ibronectin，FN）刺激的HSCs增殖、凋亡及凋亡执行者Caspase上表达的影响，为利用RGDS四肽调控HSCS增殖与凋亡提供实验理论依据。方法：应用体外HSCS培养技术，采用h－胸腺嗜陡核昔（怕1dR）掺入法测定HSCs增殖；膜联蛋白（AnnexinN）／碘化丙陡瞩I)双标记流式细胞 2 中文摘要 术团ow cytom呐，FCM卜 TU’NEL、扫描电镜及透射电镜等方法测定 HSCS凋亡；采用甲苯胺兰染色方法测定细胞粘附率；应用流式细胞方 法测定Caspase习蛋白表达。 结果：①RGDS四肽 25pg·InL”‘、50pg·InL”‘、100ng·InL”’组对 HSCS ’H－TdR掺入结果与对照组、FN组相比，均显著下降，Pwto．of，掺人 抑制率分别是16．55％、50．23％、65．33％；100ng·InL”‘浓度组作用 12hr、 24h、48h的掺入抑制率分别是62．73o、74．23o、80．22o。巨RGDS 四肽对HSCs增殖有显著抑制效应，并呈剂量、时间依赖关系。RGES 四肽对 HSCS’H丁皿掺入无抑制作用。②RGDS四肋对 HSCS凋亡的 诱导作用亦呈剂量和时间依赖关系：Annexin－Vrpl法检测，RGDS四肽 干预 48hr后各组凋亡率分别为 9．49O左7．67