目的:近年来恶性肿瘤的发生率和死亡率呈上升趋势,严重危害着人类健康。胃癌是我国、日本、韩国等东亚国家高发恶性肿瘤之一,胃癌的发生发展是个人、环境及其他多种因素、多阶段共同作用的结果,包括遗传学,表遗传学及环境因素等。表遗传学事件成为近些年研究的热点,通过影响基因转录活性抑制基因表达,却不涉及DNA序列的改变。表遗传学修饰包括DNA甲基化,组蛋白修饰,染色体重塑,RNA干扰等,其中DNA甲基化和组蛋白修饰两种表遗传学现象研究最为广泛。肿瘤抑制基因失活包括基因缺失,基因突变和DNA异常甲基化三种机制。研究显示胃癌发生、发展和形成过程中肿瘤抑制基因发生甲基化频繁出现。食管癌相关基因4(Esophageal Cancer Relaetd Gene4,ECRG4),是98年中国医学科学院Bi等利用m RNA差异显示技术从食管癌组织中分离得到的。该基因位于人染色体2q14.1-14.3,有4个外显子,全长12,500bp,其开放阅读框架为444bp,编码148个氨基酸多肽链,蛋白产物分子量为17k Da,在该基因的核心启动子区、第一外显子和第一内含子5′端的大约1kb的范围内分布有多个Cp G岛,多个Cp G岛在启动子区出现是抑癌基因典型的结构特征,提示在食管癌中ECRG4的表达调控机制很可能与DNA甲基化密切相关。研究发现ECRG4主要在上皮组织中表达,促进细胞的分化、成熟。近来的研究发现ECRG4在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等多种癌组织中表达下调或沉默,可能为一种候选的肿瘤转移抑制基因。然而ECRG4在胃癌中的表达情况,以及是否存在DNA异常甲基化,目前国内外尚缺乏报道。本研究旨在探讨ECRG4在胃癌中的表达情况及可能的分子调节机制。首先我们在组织和细胞两个水平上检测ECRG4的表达情况,发现胃癌中存在ECRG4表达下调的现象,分析ECRG4的表达水平与临床病理学特征的关系,进一步通过体外实验,构建的转染致ECRG4表达沉默胃癌细胞株,观察ECRG4表达沉默后对胃癌细胞株的增殖和侵袭能力的影响,揭示ECRG4与胃癌发生、发展和转移的关系。研究的第三部分我们通过检测ECRG4启动子区Cp G岛甲基化状态,分析其与ECRG4表达下调是否相关,进一步分析ECRG4启动子区异常甲基化与临床病理学因素之间是否存在相关性。在体外实验中,我们进一步研究胃癌细胞株在去甲基化制剂的作用下ECRG4表达是否可以逆转,探讨5-Aza-d C药物调控的意义及治疗胃癌的潜在临床应用价值。方法:一、实验对象从Gene Expression Omnibus数据库中获取胃癌基因表达谱数据集GSE62254;2010年1月~2011年7月中国医科大学附属第一医院肿瘤外科行根治性手术治疗的胃癌患者,癌和癌旁组织配对共102例;人胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823、AGS和MKN-45,永生化正常人胃细胞株GES1。二、实验方法1、针对GSE62254数据集,我们采用GEO2R进行胃癌组织及正常组织间差异基因分析。2、细胞培养:人胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901、AGS、MKN-45和永生化正常人胃细胞株GES1均按常规培养。3、q RT-PCR分别检测ECRG4基因的m RNA在组织和细胞两个水平的表达情况。4、Western-blot检测5株细胞ECRG4蛋白表达含量。5、免疫组织化学检测胃癌和癌旁组织中ECRG4蛋白表达水平及位置。6、应用CCK-8法检测构建的转染致ECRG4表达沉默胃癌细胞株BGC-823的细胞增殖能力变化。7、应用Transwell侵袭实验检测构建的转染致ECRG4表达沉默后胃癌细胞株BGC-823的侵袭能力变化。8、甲基化特异性PCR法检测ECRG4基因DNA启动子甲基化状态。9、去甲基化制剂5-Aza-d C处理ECRG4表达下调的胃癌细胞株,检测ECRG4表达变化情况。结果:一、ECRG4在胃癌中低表达,并与组织分化及淋巴结转移密切相关1、我们展示了胃癌GSE63089数据集中下调最明显的100个基因的热图。其中,ECRG4在正常胃组织中的表达水平约为胃癌组织的2.46倍(log fold changes[log FC]=2.46,p<0.01)。2、q RT-PCR结果显示,ECRG4在4株胃癌细胞中的m RNA表达水平均低于胃正常粘膜上皮细胞GES1(P<0.01),其中胃癌细胞株中,BGC823中表达最高,MKN45中表达最低。Westen-blot检测ECRG4蛋白表达结果与其m RNA结果相似。3、免疫组化结果显示,ECRG4表达在正常胃粘膜细胞和分化较好的胃癌细胞的细胞浆内。102例胃癌组织中,ECRG4蛋白在38例(37.3%)呈阴性表达,而癌旁正常组织中仅有4例(3.9%)呈阴性表达,差异显著(P<0.01)。35例胃癌组织中ECRG4的m RNA表达水平明显低于相应癌旁组织,差异显著(P<0.01)。且胃癌组织ECRG4表达水平与组织分化程度(P<0.01)和淋巴结转移情况(P<0.05)密切相关。二、抑制ECRG4表达可促进胃癌增殖、侵袭能力筛选ECRG4相对高表达的胃癌细胞株BGC-823,采用干扰质粒沉默ECRG4表达后,CCK-8法检测提示胃癌细胞株BGC-823的增殖能力明显增加,Transwell实验提示其侵袭能力明显增强。三、ECRG4表达下调和启动子区异常甲基化的关系和5-Aza-d C诱导ECRG4去甲基化的实验研究1、甲基化特异性PCR检测5株细胞中ECRG4启动子甲基化情况,结果显示BGC823、SGC7901、MKN45和AGS这4株胃癌细胞均显示ECRG4基因DNA甲基化;其中MKN45甲基化条带最强,而GES1则显示部分甲基化。2、74例胃癌组织中ECRG4基因启动子区甲基化发生率为66.2%,部分甲基化发生率为21.6%,非甲基化率为12.2%。而相应的74例癌旁正常组织中ECRG4基因启动子区甲基化、部分甲基化、非甲基化发生率分别为18.9%、29.7%、51.4%。胃癌组织中ECRG4基因启动子区甲基化发生率显著高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05),分析ECRG4基因与胃癌临床病理学参数关系,发现与肿瘤浸润深度及TNM分期密切相关,而与其他病理学参数无统计学相关性。3、对ECRG4低表达的胃癌细胞株BGC823采用去甲基化制剂5-Aza-d C处理。结果显示,作用后ECRG4表达水平m RNA和蛋白水平明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1、胃癌细胞和组织中存在ECRG4表达下调,且与胃癌淋巴结转移和胃癌分化程度密切相关。2、si RNA转染致ECRG4表达沉默后,胃癌细胞的增殖和侵袭能力明显增强。3、胃癌细胞和组织中均表现出ECRG4基因启动子区甲基化,胃癌组织中ECRG4基因启动子区甲基化发生率显著高于癌旁正常组织,且与肿瘤浸润深度及TNM分期密切相关。ECRG4启动子区Cp G岛的异常甲基化可能是胃癌组织ECRG4表达水平下调的机制之一。4、去甲基化制剂5-Aza-d C可以使ECRG4低表达的胃癌细胞BGC823恢复表达。