论文部分内容阅读
目的:白藜芦醇（Resveratrol,RES）是植物（主要是种子植物）在遇到真菌感染、紫外线照射等不利条件时产生的植物防御素,对植物本身起保护作用。随着对白藜芦醇研究的深入,人们多方面的研究结果证实其具有许多重要的生理活性,如:保护心血管系统、免疫调节、抗氧化、抗炎、雌激素样作用、延缓衰老、影响骨代谢、抗癌、抑菌等作用。由于白藜芦醇抑菌作用的研究较少,尤其是对真菌的报道甚少,并且对其作用效果和机制尚未明确,因此为了进一步探讨RES的抗菌活性及其机制,我们选取真菌中的浅部感染真菌——皮肤癣菌和深部感染真菌——白假丝酵母菌生物膜进行体外抗菌作用的研究。第一部分白藜芦醇对皮肤癣菌抑制作用及其机制研究方法:参照临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》（M38-A）,采用微量稀释法对RES进行定量实验,获得白藜芦醇对羊毛状小孢子菌（Microsporum lanosum,M.l）、石膏样小孢子菌（Microsporum gypseum,M.g）、絮状表皮癣菌（Epidermophyton floccosum,E.f）以及串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme,F.m）等常见皮肤癣菌的最低抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentrations,MIC）,同时分别选取正常对照组及实验组的M.l应用透射电镜观察RES对真菌细胞微观结构的影响。结果:RES对27株M.l的MIC50和MIC90分别为0.064mg/mL、0.128mg/mL,对13株M.g的MIC50和MIC90分别为0.128mg/mL、0.256mg/mL,对11株E.f的MIC50和MIC90均为0.128mg/mL。但对12株串珠镰刀菌的作用效果却不理想,在最高实验浓度下仍未对菌体生长产生明显的抑制作用。通过透射电镜可以观察到M.l其正常对照组菌丝切面形态规则,细胞结构完整清晰,细胞壁边缘整齐、完整,厚薄均匀,细胞器丰富,密度较大,细胞基质较密,可以清晰地看到线粒体、核糖体、细胞核等;经0.064 mg/mL的RES作用后,部分细胞的细胞壁疏松、层次不清,细胞基质变淡,细胞外有明显高电子致密颗粒聚集,细胞体积明显变小,细胞器结构模糊,大部分消失,可见较多的泡状结构;经0.128 mg/mL的RES作用后,细胞壁缺损严重并剥脱破裂,细胞膜变薄,可见不规则核位于一侧边缘,核膜断裂、溶解消失,细胞器完全消失,呈现髓样化、空泡化特征。RES对M.l等皮肤癣菌有良好的抑制作用,电镜照片证实了对其抑制作用呈浓度相关性。第二部分白藜芦醇体外抗白假丝酵母菌生物膜作用的研究方法:1白假丝酵母菌生物膜的制备2通过倒置显微镜、扫描电子显微镜观察白藜芦醇对白假丝酵母菌生物膜的形态学影响3 XTT减低法测定白藜芦醇抑制白假丝酵母菌生物膜生长的最小药物浓度SMIC（Sessile Minimal inhibitory concertrations,SMIC）4采用SPSS13.0统计软件包分析数据,利用独立样本t检验对实验组及阳性对照组OD值的组间比较进行差异性分析。结果:1倒置显微镜下RES对白假丝酵母菌生物膜形态学的影响:正常对照组中,可见很多菌丝与酵母细胞,构成密集的生物膜;在0.128mg/mlRES作用下,可见部分酵母细胞的聚集,菌丝变短,酵母细胞短小;在0.256mg/ml的RES作用下,只出现少数的酵母细胞。2扫描电子显微镜下RES对白假丝酵母菌生物膜形态学的影响:从超微结构的角度可以观察到在正常对照组中,呈现较均匀、密集的真菌黏附于PVC材料上,大量真菌细胞聚集成团,密度大,成团块状;进一步放大,细胞之间有纤维样物质交联,此外,可见菌体的细胞壁光滑,菌体规则。实验组中,电镜下菌落明显稀疏分布,并且数量减少;进一步放大,可见纤维样物质消失,并且菌体的细胞壁形态欠饱满、表面欠光滑,可见脊状突起,菌丝断裂。3 RES对白假丝酵母菌生物膜SMIC随着RES浓度递增,其对白假丝酵母菌生物膜的抑制作用呈增强趋势,SMIC50（抑制生物膜50%生长的最低抑菌浓度）、SMIC80（抑制生物膜80%生长的最低抑菌浓度）分别是0.128、0.256mg/ml。4统计学分析:实验组OD值均低于阳性对照组,当RES浓度分别为0.064、0.128、0.256、0.512、1.024mg/ml时,两组间OD值差异有统计学意义,p<0.05。当RES浓度分别为0.016,0.032mg/ml时,两组间OD值差异无统计学意义。结论:1白藜芦醇在较低的浓度下对浅部感染真菌——皮肤癣菌和深部感染真菌——白假丝酵母菌生物膜均有很好的抑制作用,为临床应用和新药研究提供有力依据,有望成为临床治疗感染的一种新药。2通过以上实验我们初步推断RES干扰皮肤癣菌是通过干扰细胞壁的合成,抑制1,3-β-D-葡聚糖合成酶、甘露聚糖-蛋白质复合物、甲壳质合酶或细胞壁鞘类磷脂生物合成等机制,再由破损的细胞壁进入细胞内部,在破坏细胞壁的同时亦可损伤细胞膜,通过与麦角甾醇结合或干扰麦角甾醇的合成,导致细胞内的重要物质如钾离子、氨基酸和核苷酸等外漏,破坏细胞膜结构的完整性以及膜内的正常代谢,而当药物透过细胞膜进入菌体后,通过干扰核酸、蛋白质等细胞器的合成,而线粒体和核膜可能首先受到影响,至出现细胞器的完全破坏以及细胞膜的溶解,进而影响菌体生长代谢;而RES对白假丝酵母菌生物膜的抑制作用可能是其通过与生物膜黏附的表面和真菌细胞自身作用,改变两者之间通过化学键、疏水性等发生受体和配体间的特异性结合,减少两者之间的相互作用,从而导致真菌生物膜细胞的脱落;或者RES分子直接作用于生物膜中菌株分泌的细胞外基质——甘露糖蛋白,使其丧失细胞之间的黏附力,影响细胞之间的疏水性,使黏附力下降,进而再破坏菌株;或者药物通过真菌生物膜立体网状结构中大小不等的间隙及孔道后渗入生物膜后,吸附于真菌细胞的细胞壁上,直接干扰细胞壁的合成,通过破损的细胞壁进入细胞内部,抑制真菌细胞的繁殖,导致其死亡。