论文部分内容阅读
聚焦超声消融手术（focused ultrasound ablation surgery,FUAS）或高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound,HIFU）技术用于治疗乳腺癌的效率仍有待于进一步提高。为此,针对如何提高HIFU治疗效率的各种研究则应运而生。其中最如火如荼的莫过于HIFU增效剂的研究。课题组近年开始开展对生物靶向性HIFU增效剂的研究,以厌氧菌双歧杆菌（Bifidobacterium,Bifi）作为特异性靶向肿瘤组织的载体,通过化学或物理的连接方式与传统的HIFU增效剂结合后,靶向性递送到肿瘤部位进行HIFU增效,取得了一定的研究成果,开启了对生物靶向性HIFU增效剂的新尝试。但前期研究发现,以Bifi为HIFU增效剂的载体,只能解决传统HIFU增效剂靶向性不强的问题,且Bifi与传统HIFU增效剂的各种连接方式或多或少存在一定的难点和不稳定性。更为重要的是,目前只能通过在Bifi的表面连接HIFU增效剂,仍然不能解决传统HIFU增效剂存在的诸如安全性不够高、靶区蓄积的量不足和靶区滞留时间短等问题。所以,如何提高靶区蓄积的HIFU增效剂的量、延长靶区滞留时间、提高安全性和肿瘤靶向性,是目前亟待解决的问题!为此,本研究试图以基因工程菌-大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）作为“寻靶剂”,将携带声学报告基因（Acoustic reporter genes,ARG）的质粒转入E.coli体内,并使其稳定复制和表达,编码产生一种新的、独特的纳米尺度的气囊（Gas vesicle,GVs）,制备出一种基于E.coli“自产”GVs的细菌蛋白纳米粒（以下统一简称为GVs-E.coli）作为一种新型生物靶向性HIFU增效剂,并通过体外和体内实验来评价其HIFU增效效果、联合HIFU治疗乳腺癌的疗效,以及初步探讨其用于HIFU增效的机制。目的探究GVs-E.coli能否作为一种新型生物靶向性HIFU增效剂对HIFU治疗实体肿瘤产生协同作用,并初步探索其增效机制。方法1.通过基因工程技术制备GVs-E.coli,生物透射电镜观察其结构。2.GVs-E.coli超声成像能力的评估:（1）体外超声成像:将E.coli、GVs-E.coli（1×107 CFU）分别置于琼脂凝胶模型中,在常规二维超声模式和造影模式下进行超声成像,并对两种模式下感兴趣区域的超声信号灰度值进行定量分析。（2）体内超声成像:选取3只肿瘤大小约为0.6mm×0.6mm×0.6mm左右的荷瘤鼠,瘤内注射GVs-E.coli（1×107CFU）,分别在注射前后对肿瘤部位进行常规二维超声模式和造影模式超声成像,并对两种模式下感兴趣区域的超声信号灰度值进行定量分析。3.验证GVs-E.coli的安全性:将30只健康雌性BALB/c鼠随机分为6组:（1）对照组（不做任何处理）;（2）注射GVs-E.coli后30min;（3）注射GVs-E.coli后1d;（4）注射GVs-E.coli后3d;（5）注射GVs-E.coli后7d;（6）注射GVs-E.coli后14d,将最大耐受剂量（1×107 CFU）GVs-E.coli经尾静脉注射入BALB/c鼠体内,通过监测BALB/c鼠体重变化、血常规和血生化指标以及重要脏器组织行H&E染色,用以验证GVs-E.coli在体内的安全性。4.验证GVs-E.coli的靶向性:将25只荷瘤鼠随机分为5组:（1）对照组（不做任何处理）;（2）注射GVs-E.coli后1d;（3）注射GVs-E.coli后3d;（4）注射GVs-E.coli后7d;（5）注射GVs-E.coli后14d。将最大耐受剂量（1×107 CFU）GVs-E.coli经尾静脉注射入荷瘤鼠体内,连续注射3天。在各个对应的时间点,将荷瘤鼠实施安乐死以后,收集肿瘤组织和重要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺以及肾脏）进行组织匀浆后,观察一次性细菌培养皿中菌落生长情况。5.GVs-E.coli用于体外HIFU增效的评价:将新鲜牛肝组织切成10cm×10 cm×10 cm大小,脱气后进行实验。实验分组设置为:（1）PBS;（2）E.coli;（3）GVs-E.coli。将PBS（100μL）以及制备好的E.coli、GVs-E.coli（1×107 CFU）直接注射到牛肝组织内进行不同参数的HIFU点辐照（120W 5S、150W 5S、180W 5S）。观察HIFU辐照即刻靶区灰度值变化,测量凝固性坏死体积。在HIFU辐照的同时进行空化信号的检测。6.GVs-E.coli用于体内HIFU增效的评价:将15只荷瘤鼠随机分为3组:（1）对照组,（2）E.coli+HIFU组,（3）GVs-E.coli+HIFU组。然后经尾静脉分别注射PBS（100μL）、E.coli及GVs-E.coli（1×107CFU）,连续注射3天。在注射后的第7天,将荷瘤鼠麻醉后,对肿瘤区域进行HIFU点辐照（辐照参数为:150W,5S）。观察被辐照肿瘤组织的灰度值变化,于辐照后24 h对肿瘤组织行TTC染色,观察并计算凝固性坏死体积和能效因子。HIFU辐照的同时,监测空化信号。7.GVs-E.coli联合HIFU治疗乳腺癌的实验:将30只荷瘤鼠随机分为6组:（1）对照组,（2）HIFU组,（3）E.coli组,（4）GVs-E.coli组,（5）E.coli+HIFU组,（6）GVs-E.coli+HIFU组。经尾静脉分别注射PBS（100μL）、E.coli、GVs-E.coli、E.coli、GVs-E.coli（1×107 CFU）,连续注射3天。监测荷瘤鼠的体重以及肿瘤体积随治疗时间的变化曲线,计算肿瘤抑制率。对肿瘤组织进行H&E,PCNA和TUNEL免疫组化分析,评价治疗效果。结果1.成功表达GVs的E.coli会变成乳白色“泡沫状”漂浮于菌液表面;TEM下可直观观察到E.coli内部大量的棱形、纺锤状蛋白纳米结构（GVs）,证明GVs-E.coli的成功制备。2.GVs-E.coli超声成像:（1）体外超声成像结果显示:与单纯E.coli组相比,GVs-E.coli在二维超声模式具有良好的超声成像效果;在造影模式下,单纯E.coli不能显像,相反的,GVs-E.coli在造影模式下超声成像强度明显增强。对不同条件下两组超声成像灰度值进行定量统计,差异具有统计学意义（p<0.001）。（2）体内超声成像结果显示:注射GVs-E.coli前,在常规二维超声模式和造影模式下,肿瘤内部信号均匀,超声信号灰度值较低;相反地,注射GVs-E.coli后,在常规二维超声模式和造影模式下,肿瘤内部信号增强且不均匀,在造影模式下信号增强更明显,超声信号灰度值增加明显,差异具有统计学意义（p<0.001）。3.GVs-E.coli的安全性:（1）最大耐受剂量（1×107 CFU）下,GVs-E.coli经尾静脉进入BALB/c鼠体内后,实验组BALB/c鼠的体重增长趋势与对照组BALB/c鼠体重增长趋势基本一致。（2）最大耐受剂量（1×107 CFU）下,GVs-E.coli经尾静脉进入BALB/c鼠体内后,与对照组相比,实验组BALB/c鼠的血常规指标和血生化指标基本与对照组水平保持一致。（3）最大耐受剂量（1×107 CFU）下,GVs-E.coli经尾静脉进入BALB/c鼠体内后,实验组各重要脏器组织的H&E染色在光学显微镜下观察,与对照组所对应脏器组织无显著性差异,各重要脏器组织未见明显的病理结构改变。4.GVs-E.coli的肿瘤靶向性:随着注射时间的延长,涂布各重要脏器组织（心脏、肝脏、脾脏、肺以及肾脏）的平板上几乎不可见单菌落生长。相反的,涂布肿瘤组织的平板上的菌落数随着时间的延长不断增加,证明GVs-E.coli对肿瘤组织有特异靶向性。5.GVs-E.coli体外HIFU增效:当各组HIFU辐照参数（辐照频率、辐照时间）相同时,GVs-E.coli组的灰度变化值和凝固性坏死体积值均比E.coli组及PBS组的灰度变化值和凝固性坏死体积值大（p<0.05）,并且,在同一实验组别中,HIFU辐照时间相同的情况下,随着HIFU辐照频率的增加,各实验组靶区灰度变化值和凝固性坏死体积值也明显增加。在HIFU辐照GVs-E.coli组的同时,PCD检测到典型的空化信号。6.GVs-E.coli体内HIFU增效:HIFU辐照（150W 5S）后,GVs-E.coli组乳腺癌肿瘤组织被辐照区域出现的灰度变化值（61.38±2.62）和凝固性坏死体积（215.18±6.75 mm3）均比E.coli组及PBS组的灰度变化值（17.92±0.78、8.92±0.46）和凝固性坏死体积值（92.56±3.67 mm3、57.68±4.44 mm3）大,差异具有统计学意义（p<0.001）;GVs-E.coli组的EEF值（2.44±0.08 J/mm3）比E.coli组及PBS组的EEF值（5.68±0.23 J/mm3、9.16±0.77 J/mm3）小,差异具有统计学意义（p<0.001）。并且,在150W 5S的辐照条件下,GVs-E.coli+HIFU组中检测到的空化信号最明显,RMS幅值增加最显著。7.GVs-E.coli联合HIFU治疗乳腺癌:在注射GVs-E.coli后的第21天,GVs-E.coli+HIFU组的相对肿瘤体积减小最为明显,其肿瘤抑制率可以高达87%,较其他实验组而言,差异具有统计学意义（p<0.001）;肿瘤组织的H&E、PCNA和TUNEL染色结果均显示,GVs-E.coli+HIFU组的肿瘤细胞产生坏死和凋亡最为显著。在治疗期间,各实验组荷瘤鼠体重增长趋势与对照组体重增长趋势基本一致,证明GVs-E.coli联合HIFU治疗的安全性和有效性。结论1.本课题成功制备了GVs-E.coli,其具备良好的超声成像能力。2.GVs-E.coli具有较好的安全性和特异性靶向肿瘤组织的能力。3.GVs-E.coli在体外和体内均具备良好的增效HIFU消融的能力,初步认为空化效应在其增效过程中发挥主要作用,GVs-E.coli有作为一种新型生物靶向性HIFU增效剂的潜力。4.GVs-E.coli联合HIFU治疗乳腺癌能起到协同治疗的作用,有望为乳腺癌的临床治疗提供一种新的方法和思路。