胃癌居我国恶性肿瘤死亡人数之首位,化疗仍是其主要的治疗方法之一,然而尽管新的抗癌药物及化疗方案不断推出,治疗效果仍无重大进展,其主要原因就是胃癌细胞对化疗药物产生了多药耐药(multidrug resistance,MDR)。MDR是肿瘤化疗失败的主要原因,也是目前化疗急需解决的关键问题。成功地逆转肿瘤的MDR有赖于对MDR表型形成机制的充分了解。目前已知多种胃癌耐药相关分子,如MDR1/P-gp、MRP、BCRP、TopoⅡ及GST-π等参与胃癌MDR的形成,但针对他们的抑制剂并不能完全逆转胃癌的多药耐药,这提示存在其它的耐药机制,有待寻找新的耐药相关基因。国内外研究表明,可溶性耐药相关钙结合蛋白Sorcin在多种药物筛选的MDR细胞中大量表达。我们以往的研究中,运用蛋白质组学技术比较了长春新碱(VCR)诱导形成的胃癌耐药细胞SGC7901/VCR和SGC7901细胞蛋白质表达谱的差异,发现Sorcin在SGC7901/VCR中显著高表达;用Sorcin反义寡核苷酸抑制Sorcin在胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR中的高表达后,增强了SGC7901/VCR对长春新碱的敏感性,SGC7901/VCR的耐药性发生了逆转,细胞凋亡率也明显增加,说明Sorcin高表达与SGC7901/VCR耐药性密切相关。但其在胃癌多药耐药中的作用及其机制尚不清楚。本研究在我们以往研究的基础上,进一步阐明Sorcin编码基因在胃癌MDR形成中的作用及其机制,使我们更全面、深入地理解和认识胃癌多药耐药的发生及调节机制,为克服胃癌的MDR提供依据。目的1.构建FLAG-Sorcin融合蛋白表达系统,为后续的Sorcin蛋白相互作用蛋白质的研究奠定基础。2.研究经基因转染形成的Sorcin高表达在胃癌SGC7901细胞多药耐药形成中的作用。3.探讨Sorcin参与胃癌MDR的作用机制,为以Sorcin为靶点逆转胃癌的MDR提供实验依据。方法一.pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表达载体的构建采用逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)扩增Sorcin编码基因cDNA片段编码区序列全长,利用DNA重组技术构建pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表达载体,DNA序列分析验证目的片段。二.Sorcin高表达的SGC7901细胞模型的建立及Sorcin对胃癌多药耐药作用的研究1.通过脂质体介导将pcDNA3.1-Sorcin-FLAG质粒转染至胃癌SGC7901细胞,G418筛选获得稳定表达Sorcin的细胞克隆。2.RT-PCR及Western blot分别检测转染细胞Sorcin mRNA表达水平和蛋白表达水平。3.MTT法测定转染细胞及对照细胞对各种化疗药物的敏感性。4.用Sorcin反义核苷酸(ASO)转染Soricn高表达的SGC7901细胞,RT-PCR检测Sorcin表达水平的变化,MTT法测定转染ASO后细胞对VCR敏感性的变化。三.Sorcin对胃癌SGC7901细胞多药耐药作用机制的探讨1.应用Wester Blot法检测Sorcin高表达对SGC7901细胞中P-gp表达水平的影响;2.MTT法分析维拉帕米(VRP)对Sorcin高表达的SGC7901细胞耐药的逆转作用;3.采用高效液相色谱法分析Sorcin高表达对SGC7901细胞内药物浓度的影响;4.应用流式细胞仪检测Sorcin对SGC7901细胞凋亡的影响。结果一.pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表达载体的构建RT-PCR法扩增出616 bp的全长Sorcin cDNA片段,并将其克隆至pcDNA3.1-P53-FLAG质粒,正反向DNA测序结果表明,所测插入cDNA片段的序列与基因库中的Sorcin序列完全相符,并包含FLAG序列,成功构建了FLAG-Sorcin融合表达载体pcDNA3.1-Sorcin-FLAG。二.Sorcin高表达的SGC7901细胞模型的建立及Sorcin对胃癌多药耐药的作用1.利用脂质体成功将pcDNA3.1-Sorcin-FLAG转染至SGC7901细胞,G418筛选出稳定表达Sorcin的阳性细胞克隆;2.RT-PCR及Western blot证实,Sorcin转染的SGC7901细胞中Sorcin较其亲代SGC7901细胞显著高表达;3.Sorcin高表达的SGC7901细胞(SGC7901-F-Sor)对长春新碱(VCR)、阿霉素(ADM)、紫杉醇(Taxol)、氟尿嘧啶(5-FU)分别产生了8.87倍、6.13倍、6.67倍和2.80倍耐药;4.Sorcin反义寡核苷酸转染SGC7901-F-Sor细胞后,RT-PCR验证Sorcin表达被抑制,MTT结果显示细胞对VCR敏感性增加,耐药被部分逆转。三.Sorcin对胃癌SGC7901细胞多药耐药作用机制的探讨1.Western blot结果显示P-gp在SGC7901细胞及SGC7901-FLAG细胞中有微弱表达,转染Sorcin的SGC7901-F-Sor细胞较SGC7901细胞P-gp表达明显增高,但低于耐药细胞SGC7901/VCR的表达。2.药物敏感实验显示,对细胞在10%以下抑制作用的不同剂量VRP与VCR联用时,VCR对胃癌细胞SGC7901的作用不随VRP的浓度变化而改变;VCR对SGC7901-F-SOR细胞的抑制作用随VRP的浓度上升而增强,耐药被逆转,逆转倍数分别为1.21(VRP2.5ug/ml),2.05(VRP5ug/ml),4.24(VRP10ug/ml)。3.利用HPLC法检测细胞内VCR浓度,发现Sorcin高表达的SGC7901细胞较其亲本SGC7901细胞细胞内VCR浓度明显降低了76.89%,而VRP能增加VCR在细胞内的蓄积,VRP处理后,SGC7901-F -Sor细胞内VCR浓度增加2.41倍,VRP对未转染的SGC7901细胞内长春新碱的浓度无明显影响;同样利用HPLC法检测细胞内ADM浓度,发现Sorcin高表达的SGC7901细胞较其亲本SGC7901细胞细胞内ADM浓度降低了80.62%。4.流式细胞仪分析结果显示,VCR处理后SGC7901细胞出现了明显凋亡,细胞凋亡率约13.0%,而转染了Sorcin的SGC7901-F-SOR细胞凋亡率则只有约3.26%,明显低于SGC7901细胞。结论1.成功构建了FLAG-Sorcin融合表达载体pcDNA3.1-Sorcin-FLAG,建立了Sorcin高表达的胃癌SGC7901细胞系,为Sorcin相互作用蛋白质的研究奠定了基础。2.Sorcin高表达可致胃癌细胞SGC7901产生低—中度的多药耐药,而反义寡核苷酸抑制Sorcin的表达后可逆转其耐药,说明Sorcin参与SGC7901细胞多药耐药表型的形成。3.Sorcin参与SGC7901细胞的多药耐药与P-gp密切相关,P-gp特异性阻断剂可逆转Sorcin介导的耐药。4.Sorcin高表达可减少SGC7901细胞内化疗药物的蓄积,并可抑制化疗药物诱导的胃癌细胞凋亡,从而使SGC7901细胞产生耐药。