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不孕不育是生殖健康领域亟待解决的重大科学问题。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报道,约10%～15%的育龄夫妇存在生育障碍,其中由男方因素导致的不育约占50%。近半个世纪,人类精液质量显著下降,精子生成障碍已成为男性不育最常见的病因。精子生成障碍可能与环境化学污染物、遗传因子改变、表观遗传修饰异常等密切相关。在精子生成障碍的患者中有大约30%的患者是由于遗传学的异常引起的。在男性中,Y染色体和X染色体都处于单拷贝状态,其上基因发生变异后无法得到等位基因的补偿,因而表型更易出现。然而过往的研究重点关注的是Y染色体遗传变异与精子发生,而X染色体在精子生成中的作用在很长一段时间都被研究者所忽视。在人类漫长的进化过程中,Y染色体的长度逐渐缩短到原来的1/3,而X的长度一直非常稳定,这提示X染色体相比于Y染色体可能更加保守。另有研究报道,X染色体富含生殖细胞特异基因,且X连锁基因的突变能够通过女性世代传递,但不会对其生殖系统产生影响。因此,针对半合子状态的X染色体的研究将更加有利于筛选与精子生成相关的致病性基因改变。本研究拟以大样本人群关联研究为切入点,针对X染色体外显子组序列变异及其多拷贝基因拷贝数变异(copy number variants,CNV)等不同变异形式,应用高通量测序(high-throughput sequencing,HTS)等基因组学研究手段,鉴定X染色体上与精子生成障碍相关的遗传变异,并通过体外试验,阐明X染色体基因在精子生成中的重要作用。第一部分X染色体序列变异在精子生成中的作用及其机制非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)是无精子症中的严重的表现形式之一,表现为精液中无精子或极少量精子,其在成年男性中的发病率约为1%。已有越来越多的证据表明X连锁基因在精子生成中扮演着重要的作用。由于男性X染色体处于半合子状态,X连锁基因发生突变后无等位基因补偿,因而表型更易出现。因此,我们提出科学假设:X染色体基因可能存在精子生成相关的序列变异。本研究采用X染色体外显子测序技术和两阶段独立人群验证对1333例NOA病人和1141例健康对照的X染色体连锁基因的外显子进行了测序及验证。结果发现,位于4个基因(BCORL1,MAP7D3,ARMCX4和H2BFWT)中的4个低频变异与NOA显著相关。功能研究显示,Bcorl1,Mtap7 3和Armcx4基因敲减后能够影响富含精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的生殖细胞的体外增殖、细胞凋亡和周期。因此,本研究提示X连锁的BCORL1,MAP7D3和ARMCX4与NOA显著相关,其内在机制可能是通过影响SSCs进不孕不育是生殖健康领域亟待解决的重大科学问题。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报道,约10%～15%的育龄夫妇存在生育障碍,其中由男方因素导致的不育约占50%。近半个世纪,人类精液质量显著下降,精子生成障碍已成为男性不育最常见的病因。精子生成障碍可能与环境化学污染物、遗传因子改变、表观遗传修饰异常等密切相关。在精子生成障碍的患者中有大约30%的患者是由于遗传学的异常引起的。在男性中,Y染色体和X染色体都处于单拷贝状态,其上基因发生变异后无法得到等位基因的补偿,因而表型更易出现。然而过往的研究重点关注的是Y染色体遗传变异与精子发生,而X染色体在精子生成中的作用在很长一段时间都被研究者所忽视。在人类漫长的进化过程中,Y染色体的长度逐渐缩短到原来的1/3,而X的长度一直非常稳定,这提示X染色体相比于Y染色体可能更加保守。另有研究报道,X染色体富含生殖细胞特异基因,且X连锁基因的突变能够通过女性世代传递,但不会对其生殖系统产生影响。因此,针对半合子状态的X染色体的研究将更加有利于筛选与精子生成相关的致病性基因改变。本研究拟以大样本人群关联研究为切入点,针对X染色体外显子组序列变异及其多拷贝基因拷贝数变异(copy number variants,CNV)等不同变异形式,应用高通量测序(high-throughput sequencing,HTS)等基因组学研究手段,鉴定X染色体上与精子生成障碍相关的遗传变异,并通过体外试验,阐明X染色体基因在精子生成中的重要作用。第一部分X染色体序列变异在精子生成中的作用及其机制非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)是无精子症中的严重的表现形式之一,表现为精液中无精子或极少量精子,其在成年男性中的发病率约为1%。已有越来越多的证据表明X连锁基因在精子生成中扮演着重要的作用。由于男性X染色体处于半合子状态,X连锁基因发生突变后无等位基因补偿,因而表型更易出现。因此,我们提出科学假设:X染色体基因可能存在精子生成相关的序列变异。本研究采用X染色体外显子测序技术和两阶段独立人群验证对1333例NOA病人和1141例健康对照的X染色体连锁基因的外显子进行了测序及验证。结果发现,位于4个基因(BCORL1,MAP7D3,ARMCX4和H2BFWT)中的4个低频变异与NOA显著相关。功能研究显示,Bcorl1,Mtap7d3和Armcx4基因敲减后能够影响富含精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的生殖细胞的体外增殖、细胞凋亡和周期。因此,本研究提示X连锁的BCORL1,MAP7D3和ARMCX4与NOA显著相关,其内在机制可能是通过影响SSCs进而引起精子生成障碍,这为研究精子发生中的X连锁基因的作用提供了新的思路,对NOA发病机制的研究提供新的线索。第二部分X染色体连锁基因拷贝数变异在精子生成中的作用及其机制X染色体富含多拷贝基因,大部分多拷贝基因能够逃避减数分裂性染色体失活(meiotic sex chromosome inactivation,MSCI),从而在精子发生的各个阶段广泛表达。拷贝数变异(copy number variants,CNV)作为结构变异的一种主要形式,其在精子发生中具有重要意义,拷贝数异常可能是导致男性不育的病因之一。因此,我们提出科学假设:X染色体连锁多拷贝基因拷贝数变异可能是精子生成障碍重要的遗传易感因素之一。为了揭示X连锁多拷贝基因在精子生成中的作用,我们系统地研究了 447例NOA病人和485例健康对照的X连锁基因的CNV。结果发现,VCX基因拷贝数变异在病例对照间分布存在显著差异(P=5.10X 10-5)。为了进一步明确拷贝数变异的确切作用,我们对研究对象进行了亚组分析,结果显示 nuclear RNA export factor 2(NXF2)(P=9.21×10-8)和 variable charge,X-linked(VCX)(P=1.97×10-4)拷贝数的增加会显著提高NOA的患病风险。功能研究显示,VCX基因拷贝数的增加会促进细胞凋亡、缩短细胞周期的S期。上述结果提示VCX过高拷贝会增加NOA的患病风险,其可能是通过介导细胞周期和凋亡从而发挥作用。本研究为NOA的发病机制提供了新的线索。