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牙周疾病现已逐渐成为糖尿病的一种常见并发症。研究已显示,牙周疾病的发展与异常血糖水平密切相关。众所周知,牙周膜细胞在牙周组织修复与重建过程中发挥关键作用,且已证实其生物学活性可被高糖作用所影响。核因子-kB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-kB, RANKL) receptor activator of nuclear factor-kB ligand, RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin, OPG)是近年来发现的调控破骨细胞分化激活的细胞因子,其在骨代谢中起重要作用。最近研究报道,牙周膜细胞可表达RANKL,提示其可能在牙周组织修复中,通过RANK-RANKL信号通路,参与调节骨吸收过程。二甲双胍已作为抗高糖血症药物,被广泛应用在治疗糖尿病及代谢综合症中。最近研究发现,二甲双胍可通过调节骨细胞的活性及功能,抑制牙槽骨吸收。同时,二甲双胍可通过激活AMPK,负调节破骨细胞的生物学功能。结果提示,二甲双胍可有效抑制因糖尿病引起的牙槽骨吸收。本研究中,我们观察高糖对人牙周膜细胞中RANKL表达的影响,并探讨二甲双胍对高糖环境下人牙周膜细胞中RANKL表达的作用机制。刘洪臣等提出局部缓释应用抗高血糖药物有利于种植体周围的骨改建过程,并在临床成功应用于糖尿病患者种植体局部获得良好效果。目前,尚未见关于局部应用二甲双胍对糖尿病大鼠拔牙窝愈合过程作用的报道。在本研究中,我们利用壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶(chitosan/β-glycerophosphate, C/GP)系统,将二甲双胍溶液凝胶化后局部注射到GK大鼠拔牙窝中,观察RANKL表达与AMPK磷酸化程度变化,初步探讨二甲双胍在糖尿病大鼠拔牙窝愈合过程中的作用。第一部分高糖对人牙周膜细胞中RANKL表达及AMPK活性的影响目的：探讨高糖作用下人牙周膜细胞中RANKL表达及AMPK活性的变化方法：原代培养人牙周膜细胞并鉴定。分别以正常及高糖浓度培养牙周膜细胞,Real-time PCR知Western blot方法检测细胞中RANKL和OPG表达,并通过检测AMPK活化特异性底物SAMS及Westernblot检测AMPK磷酸化,观察细胞中AMPK活性变化。结果：高糖作用下人牙周膜细胞中RANKL mRNA和蛋白表达增高,且AMPK活性明显下降结论：高糖可上调人牙周膜细胞中RANKL表达且减少细胞中AMPK活性。第二部分：二甲双胍对高糖作用下人牙周膜细胞中RANKL表达的作用机制目的：探讨高糖环境下所引起的人牙周膜细胞RANKL表达增强是否与AMPK活性相关；同时观察二甲双胍是否可通过激活AMPK,调节高糖作用下人牙周膜细胞中RANKL表达方法：正常血糖环境下,通过Real-time PCR、Western blot及AMPK特异性检测,分别观察Compound C和二甲双胍对牙周膜细胞中AMPK磷酸化程度和活性及RANKL表达的影响；并通过Real-time PCR和Westernblot方法,检测高糖环境下,二甲双胍分别加入或不加Compound-C时,对牙周膜细胞中RANKL表达的影响结果：Westernblot方法及AMPK特异性检测结果显示,Compound C可降低正常血糖水平下牙周膜细胞中AMPK磷酸化程度及AMPK活性,而二甲双胍可显著增加该细胞中AMPK磷酸化程度及其活性。同时, Real-time PCR和Western blot结果还显示,Compound C可上调牙周膜细胞中RANKL mRNA和蛋白表达,而二甲双胍可下调牙周膜细胞中RANKL mRNA和蛋白表达。我们还观察到二甲双胍可显著减少高糖环境下牙周膜细胞中RANKL表达,而当同时加入CompoundC时,细胞中RANKL表达的下调可被抑制。结论：我们发现已知AMPK抑制剂Compound C可通过抑制AMPK活性,提高正常血糖下牙周膜细胞中RANKL mRNA和蛋白表达,而二甲双胍可通过激活AMPK,降低正常血糖下牙周膜细胞中RANKL mRNA和蛋白表达。结合第一部分实验结果,提示高糖作用下牙周膜细胞中RANKL表达升高与AMPK的磷酸化及活性受到抑制有关。我们还证实二甲双胍可通过激活AMPK,有效抑制由高糖引起的人牙周膜细胞中RANKL表达上调。第三部分：二甲双胍凝胶局部给药对GK大鼠拔牙窝愈合过程中RANKL表达及AMPK磷酸化的影响目的：观察拔牙窝愈合过程中二甲双胍局部应用对愈合过程中RANKL表达及AMPK磷酸化的影响；初步探讨二甲双胍作为AMPK激动剂,对拔牙窝骨改建过程中RANKL表达的作用。方法：手术拔除大鼠下颌骨左侧切牙；拔牙窝局部注射二甲双胍凝胶。实验分四组：正常大鼠拔牙组(WN);GK大鼠拔牙组(GN)、GK大鼠无二甲双胍C/GP凝胶注射组(G1)、GK大鼠二甲双胍C/GP凝胶注射组(G2)；分别在拔牙后7d,14d,21d,28d取材,通过Real-timePCR和Western blot方法,观察RANKL表达及AMPK磷酸化在各实验组中的表达及变化。结果：HE染色结果显示拔牙后28d,G2组未见C/GP结构；Real-time PCR和Western blot检测结果显示：GN组中RANKL mRNA和蛋白表达水平明显高于同时期WN组中RANKL mRNA水平和蛋白表达水平。G1组中RANKL表达情况与GN组差异不大；G2组中RANKL mRNA和蛋白表达水平较GN、G1组明显下降。Western blot结果还显示：WN组中各时期AMPK磷酸化程度差异不大。GN组中AMPK磷酸化程度明显低于同时期WN组中AMPK磷酸化程度。G1组中AMPK磷酸化程度与GN组相近；G2组中AMPK磷酸化程度较GN、G1组明显回升。结论：糖尿病大鼠拔牙窝愈合过程中RANKL表达增高且AMPK活性降低；二甲双胍可通过激活AMPK,抑制拔牙窝愈合过程中RANKL表达,进而改善糖尿病大鼠牙槽骨骨改建。