论文部分内容阅读
氧化还原酶是一类重要的工业生物催化剂,在有机合成和制药领域发挥着日益重要的作用。氧化还原酶在催化反应时通常需要辅酶参与,其中大多数氧化还原酶以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD（P）（H））作为辅酶。由于天然辅酶价格昂贵,因此从经济的角度考虑,在反应过程中使用化学计量的辅酶不可行,故构建高效的辅酶再生体系对氧化还原酶用于有机合成至关重要。与NAD（P）H再生相比,氧化型烟酰胺辅酶（NAD（P）+）再生更加困难,并且NAD（P）+再生的相关研究报道也相对较少,尤其是能用于制备级脱氢酶催化氧化反应的实例更有限。本研究基于血红素蛋白的催化多功能性,研究其催化氧化型烟酰胺辅酶再生,构建双酶及多酶耦联体系应用于催化氧化,主要研究结果如下:（1）血红蛋白（Hemoglobin,Hb）催化NAD（P）+再生。研究发现Hb能够利用H2O2催化NAD（P）H氧化,实现NAD（P）+再生。该再生体系的最适反应温度和pH分别为30°C和8.0。该再生体系与马肝醇脱氢酶（HLADH）耦联催化糠醛氧化时,当NAD+浓度为0.01 m M,反应60 h后,糠酸产率可达96%,辅酶总转化数（TTN值）约为960。该双酶耦联体系用于各种芳基醇或醛氧化,反应后目标产物产率均＞81%。此外,该再生体系还能与L-谷氨酸脱氢酶（L-glu DH）和L-乳酸脱氢酶（L-lac DH）耦联用于催化氧化L-谷氨酸和L-乳酸,分别合成α-酮戊二酸（产率为97%）和丙酮酸（产率为81%）,表明该再生体系具有较好的酶兼容性。（2）肌红蛋白（Myoglobin,Mb）催化NAD（P）+再生及机制。为了进一步提高辅酶再生效率,我们探索了其他血红素蛋白（细胞色素C,辣根过氧化物酶（HRP）及Mb）催化NAD（P）+再生。与Hb相比,结构更简单的Mb展现出更高的催化效率。而且,Mb不仅能催化天然NAD（P）+再生,还能催化人工辅酶类似物1-苄基烟酰胺（BNA+）再生,表明Mb在催化氧化型辅酶再生中具有较广的底物谱。酚类介体的添加能显著提高Mb催化NAD（P）+再生效率,最适介体为莨菪亭。将Mb催化NAD+再生体系与葡萄糖脱氢酶（GDH）耦联催化葡萄糖氧化,葡萄糖酸产率最高达98%,最高辅酶TTN达44 000。Mb与其他脱氢酶（L-glu DH、L-lac DH和HLADH）耦联催化氧化反应,产物产率均在95%以上。此外,Mb催化人工辅酶类似物BNA+再生体系耦联HLADH催化糠醇氧化,糠酸产率达97%,辅酶TTN约为190。催化机制研究表明,Mb在H2O2存在下迅速转化为铁卟啉过氧化物(FeIIIOOH Por),FeIIIOOH Por中的O-O键通过均裂和异裂两种方式形成有高催化活性的高铁化合物Mb-I和Mb-II,Mb-I和Mb-II将介体氧化后恢复到基态。介体被氧化后生成高活性的酚氧自由基,随后酚氧自由基将NADH快速氧化为NAD·,NAD·在氧气作用下转化成NAD+。（3）再生体系在醇脱氢酶催化呋喃羧酸合成中的应用。我们系统地研究了三种醇脱氢酶（Streptomyces coelicolor羰基还原酶,Sc CR;Synechocystis sp.醇脱氢酶,SADH;HLADH）的底物特异性,结果表明这三种醇脱氢酶均具有氧化醛的催化活性。上述NAD+再生体系分别耦联Sc CR和SADH用于催化氧化5-羟甲基糠醛（HMF）和2,5-二甲酰基呋喃（DFF）,合成5-羟甲基糠酸（HMFCA,产率达96%）和5-甲酰基糠酸（FFCA,产率为98%）。Sc CR催化HMF氧化合成HMFCA在50 m L体系中进行了放大实验,反应50 h后HMFCA的分离收率达92%,纯度约为95%。HLADH具有广泛的底物谱,并且能够以BNA+为辅酶催化氧化DFF合成2,5-呋喃二甲酸（FDCA）。（4）再生体系在多酶级联催化呋喃羧酸合成中的应用。由于HRP不仅能实现NAD+再生,还对半乳糖氧化酶（GO）具有明显的激活作用,因此我们将HRP与GO、脱氢酶耦联,用于催化氧化HMF,合成呋喃羧酸。GO催化HMF氧化为DFF,同时产生副产物H2O2;随后,H2O2被HRP用作氧化剂催化氧化NADH,生成NAD+;最后,脱氢酶利用NAD+将DFF氧化为FFCA或FDCA。首先,我们利用GO（来源于Dactylium dendroides）、醇脱氢酶及HRP级联催化HMF氧化,FFCA产率最高达98%,辅酶TTN约为10 000;FDCA产率最高达95%。为进一步提高多酶级联催化效率并降低酶量,我们进一步优化了酶源。结果表明,GO M3-5（Fusarium sp）、Geotrichum candidum醛脱氢酶（Gc ALDH）及HRP能选择性催化氧化HMF,48 h后,FFCA产率达＞99%,辅酶TTN为5000。在50 m L体系中进行了FFCA放大合成,FFCA分离收率为89%,纯度为98%。随后,GO M3-5、Gc ALDH、HRP和铜绿假单胞菌级联催化氧化HMF,“一锅两步法”合成高附加值产物FDCA,72h后,FDCA产率为75%。在50m L体系中进行了FDCA放大合成,FDCA分离收率为72%,纯度为93%。本研究基于血红素蛋白的催化多功能性,研究其催化氧化型烟酰胺辅酶再生及机制,构建双酶及多酶耦联体系应用于催化氧化;不仅建立了氧化型烟酰胺辅酶再生新方法,而且为呋喃羧酸的清洁、绿色制备提供了新途径。