论文部分内容阅读
高尿酸血症及痛风疾病主要是由人体内尿酸含量增高所引起,尿酸盐转运蛋白(hURAT1)位于肾小管上皮细胞基顶膜上,对尿酸的重吸收起着决定性的作用,抑制其尿酸转运能力可有效地降低人体内血尿酸浓度。为筛选尿酸转运蛋白(hURAT1)抑制剂,本研究首先利用蛋白三维结构预测方法与分子对接技术构建计算机虚拟药物筛选模型,在HK-2细胞中过表达hURAT1蛋白构建体外细胞尿酸吸收模型并通过双荧光素酶报告基因检测方法构建尿酸转运蛋白(hURAT1)启动子药物筛选模型。从生物信息学,分子和细胞水平构建三个药物筛选模型,并进行初步的应用。主要研究结果如下:1.构建hURAT1计算机虚拟药物筛选模型。通过同源建模法、穿线法和综合法分别对hURAT1蛋白进行三维结构预测,预测蛋白结构分别进行相关参数评分和比对。通过Verify-3D分析和Ramachandran图评估结果,以确定综合法ROBETTA预测的结构作为后续分子对接的最佳受体蛋白。为寻找受体蛋白的活性口袋,实验通过Leinuard、Verinuard、Benzbromarone三种阳性药物分别进行对接,根据氨基酸残基对接位点,最后初步确定其活性口袋的空间位置为center_x=6.039,center_y=2.38,center_z=4.662;size_x=28,size_y=40,size_z=28。2.构建hURAT1体外细胞尿酸吸收模型。利用分子克隆技术扩增出编码hURAT1蛋白的SLC22A12基因CDS全长,经过双酶切和T4连接方法构建标签绿色荧光蛋白的pcDNA3.1-EGFP-SLC22A12质粒载体。经转染的HK-2细胞通过荧光显微镜下观察到绿色荧光;Western blot实验结果显示,hURAT1蛋白表达量在转染pcDNA3.1-EGFP-SLC22A12质粒的HK-2细胞中高于空白对照组,表明hURAT1在HK-2细胞中成功过表达。根据体外细胞尿酸吸收实验和阳性药物处理显示,过表达hURAT1蛋白的HK-2细胞的尿酸吸收能力明显增强、尿酸吸收模型构建成功,并对二氢杨梅素、杨梅素两个黄酮化合物进行初步的筛选。3.构建hURAT1启动子药物筛选模型。通过提取HK-2细胞基因组DNA,利用PCR方法扩增出SLC22A12基因的启动子,由双酶切和T4连接的方法成功构建PGL-SLC-Pro荧光素酶启动子质粒载体。以PRL-TK质粒为内参,选择HEK-293与HK-2两种工具细胞,分别探索3:1、5:1、7:1三种质粒共转比例,最后选择HK-2细胞为工具细胞并以3:1(PGL-SLC-Pro/PRL-TK)的质粒共转比例作为启动子双荧光素酶检测的药物筛选条件,并对薏苡仁等五味中药的水、醇提物分别进行初步筛选。综上,本研究构建基于hURAT1计算机虚拟药物筛选模型、hURAT1体外细胞尿酸吸收模型和hURAT1启动子的药物筛选模型,并进行初步应用。三个模型的构建对降尿酸药物的筛选和治疗高尿酸血症和痛风疾病具有科学与实际应用意义。