骨关节病(osteoarthritis, OA)是一种发生于滑膜关节的慢性进行性疾病，以关节软骨退行性变、骨赘形成、滑膜炎症为主要特征。有关OA的发病机制至今尚未明了。最近的研究显示软骨血管新生在OA发生发展中可能扮演重要角色。但目前此方面的研究多集中于膝关节OA，且对血管新生的发生机制探讨不足。颞下颌关节(temporomandibular joint, TMJ）在发育及构造上与全身其他滑膜关节都存在着显著差别，作为OA的常见发病关节，血管新生究竟在TMJ-OA的病理发展中扮演了何种角色目前还没有研究。本研究拟通过渐进性咬合紊乱建立大鼠TMJ-OA病理模型，检测髁突骨软骨交界血管数量的改变及其与OA病理改变的关系，并进一步从基因及蛋白水平检测多种血管生成相关因子的表达水平，此外还利用病毒载体技术检测血管内皮生长因子对软骨细胞增殖及低氧诱导因子1表达的影响，以探讨髁突骨软骨交界血管新生在TMJ-OA发展中的病理作用及其出现的可能机制，以期为寻找新的TMJ-OA防治途径提供理论和实验依据。实验一渐进性咬合紊乱对大鼠髁突软骨影响的长期观察即大鼠TMJ-OA动物模型的建立目的：研究渐进性咬合紊乱对大鼠TMJ髁突的长期影响。材料和方法：8周龄雌性SD大鼠24只，随机分为实验组及对照组。利用分牙皮圈将实验组大鼠右下及左上第一磨牙移动约1mm，在第一次分牙4周后，在右下及左上第二三磨牙间重复相同操作以使第三磨牙远中移动。对照组除不进行分牙操作，其余处理与实验组相同。在实验开始的第20周和24周末，分别处死每组各一半大鼠。分别命名为20周组及24周组。对髁突标本进行处理，制成切片。病理染色，镜下观察，并利用软件对髁突软骨厚度进行测量。结果：实验组大鼠原有的尖窝咬合关系遭到破坏，形成实验性的咬合紊乱。病理染色显示对照组软骨表面完整，细胞分层清晰，排列整齐，分布均匀；实验组出现类OA样病理改变：软骨表面连续性中断，破损；肥大细胞簇集成岛状；软骨细胞钉突样增生进入软骨下骨；出现无细胞区域；类骨赘样增生；细胞外基质酸性粘多糖着色不均匀。与对照组相比，20周时实验组髁突软骨全层厚度出现显著增厚（P<0.05），但在24周两者没有显著性差异。而实验组纤维层和钙化层厚度在20周和24周两个时间点，与对照组相比都出现明显增加（P<0.05）。结论：在较长时间点渐进性咬合紊乱依然对髁突软骨产生了持久的破坏作用。同时潮线的确认也为下一步实验打下坚实的基础。实验二TMJ-OA大鼠髁突骨软骨交界处血管数量检测目的：本实验拟通过渐进性咬合紊乱建立大鼠TMJ-OA病理模型，检测髁突骨软骨交界血管数量的改变及其与OA病理改变的关系，以期为寻找TMJ-OA防治途径提供理论和实验依据。材料和方法：渐进性咬合紊乱大鼠模型建立后，第20周和24周末分别处死每组各一半大鼠。HE染色后，对髁突中后部终止于钙化软骨层的血管数量以及突破潮线进入非钙化软骨层的血管通道数量分别进行计数，同时对OA病变进行评估。利用CD34免疫荧光染色进一步对髁突骨软骨交界的血管进行观察评估。结果：HE染色结果显示，对照组中来自于软骨下骨的血管通道最远到达钙化软骨层，均被限制于潮线以下；实验组可观测到富含红细胞的血管通道突破潮线侵入非钙化软骨，且侵入位置周围的软骨细胞排列异常紊乱，或出现软骨细胞坏死。CD34免疫荧光显示，位于血管通道中的血管在实验组中可抵达钙化软骨深层，直至突破潮线侵入非钙化软骨。与同时间点对照组相比，20及24周实验组终止于钙化软骨层血管数量及突破潮线进入非钙化软骨的血管数量均出现显著增加（P<0.05）。结论：从不同角度首次证实TMJ-OA病理进程中存在骨软骨交界的血管新生现象，且与髁突软骨的OA病变存在直接联系。实验三TMJ-OA大鼠髁突血管生成相关因子蛋白及基因水平的表达检测目的：研究由何种机制诱发髁突骨软骨交界血管新生现象。材料和方法：渐进性咬合紊乱大鼠模型建立后，第20周和24周末分别处死每组各一半大鼠。取出双侧TMJ，左侧髁突头进行RNA提取，右侧TMJ制成切片。利用Real-time PCR和免疫组化技术检测样本血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor, VEGF），结缔组织生长因子（connective tissue growthfactor，CTGF），基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9，MMP9），及软骨调节素I（chondromodulin-I, CHM-I）的表达变化。结果：免疫组化染色结果显示实验组中，VEGF，CTGF及MMP9主要表达于骨软骨交界处的邻近组织中，包括肥大软骨细胞，增殖层软骨细胞，血细胞及邻近的骨细胞中；然而CHM-I则更多表达于肥大细胞浅层及增殖层软骨细胞中，在深层软骨细胞中表达较少。24周实验组CTGF，MMP9，CHM-I的mRNA及蛋白水平明显上调（P<0.05）；20周实验组中VEGF和CTGF的蛋白表达与同龄对照组相比显著增强（P<0.05）。结论：渐进性咬合紊乱导致咬合力的大小，方向，分布都出现改变，通过牙周-神经反馈机制对TMJ产生异常应力负荷。异常应力可能促使髁突软骨细胞、骨软骨交界血管通道中的血细胞及邻近的骨细胞分泌VEGF，CTGF，MMP9等促血管生成因子，并通过扩散及运输作用大量聚集于骨软骨交界区域，形成一个有利于血管内皮细胞迁移增殖的微环境，并最终导致了骨软骨交界的血管新生。反应性CHM-I的表达增强可能在增殖层或肥大层浅层中和促血管生成因子的作用，但其在深层软骨的表达减少可能也是血管侵入的原因之一。实验四ATDC5细胞系的软骨细胞化诱导鉴定及重组腺相关病毒载体rAAV-VEGF对其增殖活性及低氧诱导因子1表达的影响研究目的：诱导ATDC5细胞分化为软骨细胞，检测VEGF对软骨细胞增殖及低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor1，HIF-1）表达的影响。材料和方法：利用胰岛素铁硒传递蛋白对ATDC5细胞进行培养诱导，并分别利用阿尔新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色对其进行软骨细胞鉴定。将编码有VEGF基因的rAAV载体转入诱导后的软骨细胞，使用四甲基噻唑氮蓝比色法检测细胞增殖活性，并利用免疫荧光技术检测转染效果及软骨细胞HIF-1的表达变化。结果：开始诱导后1周，细胞逐渐凝集，开始分泌细胞外基质酸性粘多糖；诱导后2周，细胞表达Ⅱ型胶原，酸性粘多糖分泌进一步增多；诱导后3周，可见软骨结节。rAAV-VEGF可成功导入软骨细胞，导入后细胞可分泌VEGF。VEGF转染可促进软骨细胞增殖并使HIF-1的表达明显增强。结论：ATDC5细胞在特定条件下可诱导成熟为软骨细胞，VEGF可反向增强软骨细胞HIF-1的生成，推测在OA发生发展中HIF-1和VEGF之间存在一个相互促进的正向循环。