类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以侵蚀性关节炎为特性的自身免疫性疾病。RA的主要病理特征是滑膜组织的慢性炎症和血管翳的形成,关节软骨和骨骼受到侵蚀,最终导致关节畸形和功能障碍。甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）作为二氢叶酸还原酶抑制剂,由于其抗炎、抗增殖作用好、成本低,常被用作治疗RA的首选药物。然而,RA患者中对MTX治疗无反应/耐药的发生率估计在30%到50%之间。转运体对药物的转运直接关系到药物的疗效,许多研究发现药物转运蛋白与耐药有关。目前对于ATP结合盒式（ATP binding cassette,ABC）转运蛋白家族与MTX耐药关系的研究较多,已经发现P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白、乳腺癌耐药蛋白在组织或细胞中过表达能够降低药物疗效,引发药物耐药。与ABC家族转运蛋白相比,关于溶质载体（Solute carrier,SLC）转运蛋白家族与耐药关系的研究较少。有机阴离子转运体3（OAT3）作为SLC转运蛋白家族的一员,参与MTX的吸收,而炎症环境下OAT3表达是减少的,因此我们推测OAT3转运蛋白可能参与MTX耐药。本课题组前期研究发现,胶原性关节炎（Collagen-induced arthritis,CIA）大鼠滑膜中OAT3的表达较正常大鼠滑膜明显降低,PGE2炎症因子刺激正常大鼠滑膜细胞后OAT3的表达也发生降低。为探索OAT3是否参与MTX治疗RA耐药,明确OAT3是改善MTX耐药潜在的治疗靶点,我们使用CIA大鼠模型,通过关节腔注射过表达OAT3慢病毒来增加大鼠膝关节滑膜OAT3的表达,研究其对增加MTX治疗CIA大鼠疗效的影响。同时体外获取大鼠滑膜细胞,通过瞬时转染改变细胞中OAT 3的表达,并检测其对滑膜细胞吸收MTX的能力以及滑膜细胞增殖和迁移能力的变化,从体外和体内两个方面来验证。目的:研究治疗RA药物MTX产生耐药是否与OAT3有关,明确OAT3能否作为提高MTX治疗RA疗效的靶点。方法:1、使用免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）检测非炎症疾病患者和RA患者滑膜组织中OAT3的表达;使用western blot检测从RA患者和骨关节炎（Osteoarthritis,OA）患者滑膜中提取的滑膜细胞中OAT3的表达。2、体外分离培养正常大鼠滑膜细胞,实验分为正常组,NC组,OAT3过表达组,其中NC组和OAT3过表达组使用转染试剂瞬时转染相应质粒。然后给予自带荧光的MTX（100ng/ml）,培养半小时,使用激光共聚焦显微镜检测细胞中MTX的吸收情况。将上面细胞另分为对照组,TNF-α（20ng/ml）刺激组,TNF-α+MTX干预组。使用CCK-8和Transwell方法检测各组细胞的增殖活力和迁移能力。3、实验将大鼠滑膜细胞分为正常组,NC组,OAT3沉默组,其中NC组和OAT3沉默组使用si RNA-mate转染试剂瞬时转染相应si RNA。然后给予自带荧光的MTX（100ng/ml）,培养半小时,使用激光共聚焦显微镜检测细胞中MTX的吸收情况。将上面细胞另分为对照组,TNF-α（20ng/ml）刺激组,TNF-α+MTX治疗组。使用CCK-8和Transwell方法检测各组细胞的增殖活力和迁移能力。4、建立CIA大鼠模型,将动物随机分成正常组、CIA模型组、MTX治疗组。治疗组给予MTX（0.5 mg/kg/3d）治疗14天,每三天观察关节炎炎症指标（大鼠体重、全身评分、关节炎指数、关节肿胀度和关节肿胀数）。观察CIA对照大鼠的炎症表现自然缓解情况,并计算出95%的置信区间。观察MTX治疗大鼠的炎症症状缓解范围,如若缓解在CIA大鼠缓解95%置信区间范围内或低于95%置换区间最低值,则表明该大鼠炎症症状无明显恢复,如若缓解高于CIA大鼠缓解95%置信区间最高值,则表明该大鼠炎症症状得到有效的恢复。评判疗效分组的指标为前期观察的五个炎症指标;如果超过60%的指标有显著恢复则视为MTX治疗有效（MTX-E）,否则为治疗无效（MTX-N）,并计算疗效。每组随机选取部分大鼠获取滑膜组织,使用western blot和IHC检测滑膜组织中OAT3的表达,UPLC-MS/MS检测大鼠滑膜组织中MTX的含量。5、将MTX-N组随机分为对照组、NC组和OAT3过表达组。其中NC和OAT3过表达组关节腔注射相应的慢病毒,使用小动物活体成像仪器、western blot和IHC检测慢病毒在关节、外周血和组织器官中的富集情况。根据关节炎评价指标判定疗效改善情况。使用western blot、IHC和UPLC-MS/MS检测大鼠滑膜组织中OAT3的表达和MTX的含量。6、保留各组大鼠的关节,使用Hematoxylin and eosin（H＆E）法和X光检测大鼠关节病理变化和骨侵蚀情况。结果:1、IHC结果显示,RA患者滑膜组织中OAT3的表达明显低于非炎症性疾病患者;Western blot结果显示RA患者滑膜细胞中OAT3的表达低于OA患者。2、激光共聚焦结果显示,过表达大鼠滑膜细胞中OAT3的表达后,其对MTX的吸收明显高于NC组。CCK-8结果显示,滑膜细胞经过TNF-α刺激后,滑膜细胞的增殖活力明显增强,MTX能够缓解细胞的过度增殖,其中OAT3过表达组缓解的更为明显。Transwell结果显示,滑膜细胞经过TNF-α刺激后,滑膜细胞的迁移能力明显提高,MTX能够降低其迁移能力,其中OAT3过表达组降低的趋势更强。3、激光共聚焦结果显示,沉默大鼠滑膜细胞中OAT3的表达后,其对MTX的吸收明显低于NC组。CCK-8结果显示,OAT3沉默组MTX缓解滑膜细胞过度增殖的作用明显低于NC组。Transwell结果显示,OAT3沉默组MTX降低滑膜细胞迁移能力的作用明显低于NC组。4、评价CIA大鼠的体重,全身评分,足爪容积,足爪肿胀数和关节炎指数五个指标得出,MTX对CIA大鼠的治疗有效率达到48.98%。Western blot和IHC结果显示,CIA大鼠滑膜组织中OAT3的表达明显低于正常组,MTX-N组明显低于MTX-E组;UPLC-MS/MS结果显示,MTX-N组滑膜组织中MTX的含量明显低于MTX-E组。5、经检测慢病毒仅富集在大鼠关节部位。大鼠关节腔注射过表达慢病毒后疗效有很大的提高,达到80%。Western blot和IHC结果显示,NC组OAT3的表达明显低于OAT3过表达组;UPLC-MS/MS结果显示,NC组滑膜组织中MTX的含量明显低于OAT3过表达组。6、H＆E结果显示,与正常大鼠相比,CIA大鼠踝关节软骨组织出现严重损坏,有些部位出现炎症并伴随大量炎性浸润,滑膜出现异常增生,有新血管翳出现。MTX-E组症状得到明显缓解;与CIA大鼠相比,MTX-N大鼠的关节病理无明显改善。关节腔注射过表达慢病毒后,OAT3过表达组的关节炎症、细胞浸润、新生血管、滑膜异常增生明显改善。X光拍摄得出,与正常组相比,CIA模型组继发性爪骨侵蚀非常严重,MTX-E组骨侵蚀明显减轻,MTX-N骨侵蚀更严重。CIA模型组继发侧足爪骨间隙已基本消失;给药组的骨间隙尚存,但较为狭窄。MTX-N类似于CIA模型组。经追加治疗后,OAT3过表达组的骨侵蚀进一步减少,骨空间完整,只有微小或疑似病变。结论:1.OAT3介导滑膜细胞摄取MTX,调控MTX抑制滑膜细胞增殖;OAT3在RA和实验性关节炎中表达异常,参与了RA治疗药物MTX耐药的产生。2.OAT3是改善MTX治疗RA耐药的靶点之一。