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大麦为世界上仅次于小麦、水稻和玉米的第四大禾谷类作物,因其具有很高的营养价值而在世界范围内广泛种植,在农业生产中具有重要意义。大麦也是遗传研究广泛应用的模式植物之一。目前研究者们致力于利用基因工程对大麦品种进行遗传改良,但目前大麦遗传转化的技术仍存在一些问题,如能利用的基因型有限,外植体来源季节限制等。完善大麦再生技术体系,导入外源有利基因将有利于今后的大麦遗传改良。
本研究以大麦不同品种为材料,分别建立了大麦成熟胚、幼胚以及茎尖分生组织的再生体系,采用农杆菌介导法将甘蓝型油菜矮秆基因Bnrga-ds导入不同品种大麦的幼胚中,PCR鉴定证实,目的基因已经整合到大麦基因组中,得到含有目的基因的转基因植株。主要研究结果如下:
(1)以川农4060,早丰一号,华大麦4号,华大麦5号,华大麦6号,华大麦7号共6个品种当年收获的种子为材料,研究了不同的培养基、糖源、胚切割方式、外源激素的种类和浓度对大麦成熟胚愈伤组织诱导的影响,以及不同激素配比对植株再生的影响,建立了大麦成熟胚的再生体系。结果表明:Dicamba与2,4-D对幼胚愈伤诱导无显著影响。华大麦4号、华大麦5号、华大麦6号愈伤组织诱导率较高,其中华大麦4号愈伤组织诱导率高达97.45%,愈伤组织分化依然存在很大问题,华大麦4号绿点率达78.26%,但很多绿点不能出芽,最终出芽率只有23.91%。
(2)以8个大麦品种(早丰一号,皮棱波,美里黄金,浙农大3号,华大麦4号,华大麦5号,华大麦6号,华大麦7号)的幼胚为试验材料,以Golden promise、Harrington为对照,通过组织培养筛选适合转化的优良受体基因型。研究结果表明:除早丰一号愈伤组织诱导率和植株再生率相对较低外,其他品种的离体培养效果都很好,均可作为遗传转化的受体。但愈伤组织继代时间超过两个月后,愈伤组织的分化能力会随着时间逐渐下降。
(3)以华大麦7号的茎尖为外植体,研究了不同培养基对大麦茎尖切段丛生芽诱导的影响。结果表明:茎尖切段在含1.0mg/l TDZ和1mg/l6-BA的诱导培养基中能诱导出丛生芽,而在含2.0mg/l2,4-D和2.5mg/l6-BA的诱导培养基中先形成愈伤组织,后来分化出丛生芽。在没有任何激素的培养基中生根较难,在添加0.5 mg/l IBA的培养基中生根,得到根系发达的丛生苗。茎尖再生体系的建立,为今后茎尖转化奠定了基础。
(4)农杆菌介导转化大麦幼胚:选取华大麦4号、华大麦5号、华大麦6号、华大麦7号的幼胚作为受体材料,用农杆菌介导法进行矮杆基因Bnrga-ds的转化。获得117株抗性植株,经PCR电泳检测,最终得到23株阳性植株。
(5)农杆菌介导转化大麦幼胚愈伤组织:选取华大麦6号的幼胚愈伤组织作为受体材料,用农杆菌介导法进行矮杆基因Bnrga-ds的转化。研究了农杆菌菌液浓度对大麦幼胚愈伤组织转化效率的影响,优化了转化条件。研究发现若侵染25min,共培养3d,则OD600为0.6~0.7的浓度较适宜。