蛋白质广泛存在于各种生物组织和细胞中,是生命活动的物质基础。二硫键等基团间的相互作用为蛋白质产生并维持高级结构和功能提供基础。二硫键的形成对于稳定蛋白质的空间结构和保持其活性功能具有极其重要的影响,它的配对正确与否是影响蛋白质多肽链折叠的重要原因,研究二硫键对于蛋白质工程和人工药物分子设计有着积极而重要的意义。近年来,人们发现机械力在折叠过程中扮演重要角色,机械力在生物体中十分普遍,细胞和组织不得不与外力发生作用。随着仪器检测手段的革命性进步,单分子力谱技术得以空前发展。基于原子力显微镜技术的单分子力谱方法已被广泛地应用于分子内以及分子间相互作用的研究,并产生了很多有重要意义的研究成果。在第二章中,我们通过基因定点突变和蛋白融合表达的方法来研究二硫键对蛋白质结构、稳定性和生物活性等方面的影响。表达纯化得到的decorsin在ADP诱导下,半抑制浓度(IC50)为500nM,显示出对血小板聚集有很强的抑制作用,当我们将第一对硫键(cys7-cys15)突变掉以后,对血小板聚集的抑制率下降了30倍,半抑制浓度(ICso)为15μ M,而将第三对硫键(cys22-cys38)突变掉以后,我们发现蛋白对血小板聚集的抑制能力基本完全丧失。同时,二硫键的缺失使蛋白的二级结构和三级结构不可避免地遭到破坏。我们又将RGD序列以及这段序列相邻的二硫键之间的部分插入到GB1蛋白的39-40位氨基酸的loop区域中,使这段结构被GB1loop区域固定,研究发现,新构建的蛋白保留有部分的抗凝血活性。这表明了decorsin中的三对二硫键对于抗凝血功能有着协同作用,缺失任何一对都会对结构和功能造成重大影响。我们所做的关于二硫键的研究有助于基于分子结构层面上来设计一些抗凝血的蛋白类药物。在第三章中,我们首先介绍了ubiquitin及发生五种区域交换的研究背景。ubiquitin发生再折叠过程时,相邻蛋白之间会发生区域交换作用,蛋白质结构在存在该作用条件下仍然稳定。我们通过分子生物学方法分别构建出ubiquitin野生型蛋白及再折叠过程中出现的五种区域交换蛋白的基因,并在原核表达系统中进行表达,表达出的五种区域交换蛋白经过CD光谱检测发现,其二级结构与天然态ubiquitin基本保持一致。随后,我们又将ubiquitin野生型及五种区域交换蛋白与GB1蛋白融合构建出了(GB1-ubi)4四聚蛋白,通过单分子力谱实验研究ubiquitin及五种区域交换蛋白的力学稳定性。实验证实,天然态ubiquitin的力学稳定性很高,而其余五种domain swapping蛋白的力学稳定性还有待于进一步研究。在第四章中,我们主要通过单分子力谱的方法对Filamin A的两个区域的相互作用进行了研究。对于FLNa19-21这部分的特殊结构和生物学功能,我们首先研究了这部分的整体区域在外力作用下的去折叠过程,随后我们又对每一个结构域在外力作用下的去折叠作用进行了单独研究,测得了每个结构域单体的去折叠力的大小。对于在force-clamp条件下研究蛋白与配体结合前后力的变化,我们将在下一步的研究中得以证实。除此之外,我们还研究了使Filamin A形成二聚体的结构域FLNa24,通过基因定点突变和蛋白质交联的方法来研究形成二聚体的氢键相互作用的强弱。从得到的力谱曲线中我们观察到了二聚体蛋白去折叠的过程,但是对于氢键作用破坏的过程我们没有观察到。下一步,我们将通过一种新型的蛋白与蛋白交联的方法来研究蛋白之间的氢键相互作用。通过上述研究结果,我们对于二硫键在蛋白质结构、稳定性和生物活性方面的功能进行了科学的阐述,对利用单分子力谱方法研究蛋白质的相互作用有了较深入的了解,对以后进一步研究蛋白的结构和功能做出了有益的探索。