研究背景腰背部疼痛是当今困扰人类的最常见骨科疾病之一,其原因有椎间盘退行性变、腰背部肌肉劳损等,其中有约4/5的病人是以下腰痛为主要病症来医院就诊,下腰痛的最主要原因是椎间盘的退行性变。学者发现,椎间盘的退行性变与组织形态学、生物力学、遗传学、基因分子学等有关[1]。椎间盘是脊柱的重要组成部分,其在维持脊柱生理曲度及稳定性方面起着重要的作用。其主要有周围的纤维化组织,中间的髓核组织,以及上下的软骨终板组成,为脊柱应力缓冲的主要结构,起着弹性垫作用。椎间盘退变,在外力的作用下,其纤维环组织退变并破裂,中间的髓核组织通过破裂纤维环的缺口处脱出或者突出后方的椎管内,压迫相应的脊髓和神经,脊髓和神经长期受压,发生水肿、炎症,进而引起腰背痛、下肢无力、疼麻等为主、甚至截瘫的临床症状。陈立等人对椎间盘退行性变的研究表明,在正常的生物应力作用下,软骨终板上的蛋白聚糖合成和降解二者处于动态平衡,而在异常应力的作用下,软骨终板的蛋白聚糖出现合成减少、但是降解增加,打破了这种动态平衡,从而改变了椎间盘的原有组织结构成分,最终导致了椎间盘的退行性变。成年后的椎间盘细胞及组织失去了血液的营养供给,其营养主要依靠终板和纤维环的扩散方式来获取,而随着年龄的增加,椎体的终板逐渐出现钙化甚至硬化,致使椎间盘的营养途径被切断,而导致椎间盘的退行性变。目前相关学者的主要研究方向集中在椎间盘退行性变的临床治疗方法,目前针对椎间盘退行性变的主要方案相关的保守治疗以及不同方式的手术治疗,保守治疗包括相应的药物治疗、理疗及卧床休息等,仅能暂时起到缓解或部分缓解临床症状的效果,在身体劳累或者其他应力改变的情况下,上述症状会再次出现,甚至加重。而随着20世纪40年代,Jaslow和Clowoud等人将后路腰椎椎间融合术(Postive Lumbar Interbody Fusion PLIF)[2]的方法引入临床应用,临床上开始应用减压融合术来治疗椎间盘退行性变,其可明显的改善临床症状,但改变了脊柱本身的应力结构,对邻近阶段以及整个脊柱的生物力学的影响,暂时并不十分确切,上述方法虽能缓解或者部分缓解椎间盘退行性变引起的临床症状,但均无法从根本上来治疗椎间盘的退行性变。如何早期发现、并彻底治疗椎间盘的退行性变逐渐成了学者们研究的热点。随着分子生物学的发展,学者们开始着手对椎间盘退行性变的机制上进行基础研究,并有部分学者开始使用动物模型来模拟椎间盘退行性变进行基因治疗[3-4],并获得了可靠的疗效。目前研究的基因主要包括椎间盘结构相关基因(COLl Al基因、Sox9基因、COL9A2、COL9A3基因、COLll A2基因、PG基因、CILP基因等)、骨质疏松相关基因(维生素D受体基因、雌激素受体基因)、椎间盘代谢相关基因(MMP-1、MMP3基因、TIMP-1、COX-2基因、TIMP-1和COX-2基因、THBS-2基因、ADH基因等)、细胞因子相关基因(炎症相关基因、生长因子类基因等)以及信号传导通路相关基因(GTP环化水解酶(GCHl)等)。而在这其中Sox9基因因其独特的生物学作用成为研究的热点。Sox9基因在Sox基因家族中占据着重要的地位,它主要调控着人以及脊椎动物的生长发育,在软骨生成修复和决定性别方面起着决定作用[5]。1994年,Foster[6]等运用荧光原位杂交等技术,在染色体的17q24位上发现人类Sox9基因。Wagner[7]等通过快速扩增cDNA末端结合人胚胎脑的cDNA文库筛选的方法,成功分离和克隆了人类Sox9基因。随着分子生物学相关技术的发展以及对椎间盘退行性变机制研究的不断深入,从越来越多的相关试验证据中,学者们发现椎间盘的发育、成熟到退变的整个变化过程均有Sox9基因的参与。如今,学者们对Sox9基因可促进II型胶原蛋白、蛋白聚糖的生成以及细胞增殖的作用已十分明确,并对相关调控机制也有了很多了解。Gruber等[8]收集了37例(年龄从15-76岁)人类椎间盘纤维环做Sox9基因的免疫组化染色,发现在年轻人的纤维环细胞中甚至髓核细胞中Sox9基因呈均匀染色,随着年龄的增加以及椎间盘的退行性变,纤维环细胞中的Sox9基因染色逐渐的减少甚至消失。已有学者研究证实,在关节炎等相关疾病中高度表达的致炎因子可以明显的抑制Sox9基因的生物学作用,从而减弱了病变软骨的再生和修复能力,而在椎间盘退行性变过程中,Sox9基因[9]的生物学作用是否也被抑制,从而使得退变的椎间盘难以自身修复,在椎间盘退行性变的过程中是否存在Sox9基因的点突变、调控方面的缺陷及为何会出现Sox9基因的表达降低等问题有待进一步地研究。故构建安全、可靠、有效的Sox9基因重组腺病毒载体[10-11]对相关的研究十分必要,以往学者使用较多的Ad Easy系统进行腺病毒载体的构建,其在保存和产生效率方面均存在缺陷。而AdMax系统腺病毒包装系统具有操作性简便、病毒重组效率高、基因突变率低、病毒生产率高等优势,选用其构建相关Sox9基因的腺病毒载体,可为进一步研究Sox9基因在椎间盘退行性变中的作用及相关机制提供稳定可靠的腺病毒载体。应用构建的Sox9腺病毒载体感染所培养的人椎间盘髓核细胞,并观察该细胞中II型胶原蛋白及蛋白聚糖的含量发生的变化,以彻底了解该基因对人椎间盘的生物学效应。目的应用AdMax包装系统构建Sox9基因的腺病毒载体,并对其进行鉴定,为Sox9基因的相关研究提供可靠地腺病毒载体。将含Sox9基因的该腺病毒载体感染人椎间盘髓核细胞,了解其对人椎间盘细胞的生物学作用。方法1.腺病毒载体建立法运用PCR方法对Sox9基因进行扩增,将扩增后的基因筛选后重组入线性化的p AV-MCMV-GFP-3FLAG,然后转化入DH5a感受态细胞,得到转化子;运用菌落PCR技术对转化子进行鉴定,鉴定完毕后,所得到的转化子通过AdMax腺病毒包装系统转染入HEK293细胞,并在其中进行包装成熟、扩增。2.腺病毒载体的检测方法应用Western Blot检测法对Sox9基因重组腺病毒进行检测,把建立的腺病毒载体的病毒DNA进行PCR鉴定、免疫荧光组化测定以及基因测序,并进行病毒滴度测定。3.培养人退变椎间盘髓核细胞并感染鉴定好的Sox9基因载体,并通过免疫荧光染色了解退变椎间盘髓核细胞的中II型胶原蛋白的变化。结果在以Sox9基因为模板PCR扩增得到的产物大小:1565bp,并经测序结果与Sox9基因对比分析,表明阳性克隆与Sox9基因一致,说明Sox9基因扩增成功。把获得的病毒DNA进行PCR鉴定,得到1565bp片段,说明Sox9基因片段已经重组进入腺病毒。腺病毒的滴度为:2.3×1011PFU/ml。通过Western Blot检测,在72-95KDa之间可以看到阳性条带,其与Sox9-GFP-Flag的融合蛋白(56KDa+28KDa+2KDa=86KDa)的大小吻合。在感染人椎间盘髓核细胞后荧光染色后发现较对照组其II型胶原的含量增加。结论Sox9基因增加了人退变椎间盘细胞的II型胶原蛋白的增加。