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猪链球菌(Streptococcus Suis,S.suis)导致患病猪的脑膜炎,败血症以及各种化脓性炎症,是引起公共卫生危害的重要病原之一。按照荚膜抗原的血清学分类,目前共有35个猪链球菌的血清型。此外还存在不能定型或者不属于现有血清型的菌株。1.仔猪脑膜炎新型猪链球菌分离株的鉴定和毒力分析2013年3月至5月,江苏某猪场大量断奶仔猪患病死亡。发病率达35%,死亡率为90%。患病动物表现出共济失调、转圈、头部震颤等明显的脑膜炎症状。剖检9只濒临死亡的病猪发现,脑部均有不同程度的水肿和点状出血。从仔猪脑组织中分离培养获得一株细菌,命名为CZ130302。通过生化鉴定,结合16S rRNA基因和谷氨酸脱氢酶基因(gdh)的测序鉴定,确定该细菌(CZ130302)为猪链球菌。电镜观察CZ130302株有荚膜结构,与参考血清的凝集试验和多重PCR分型鉴定方法进一步确定该分离株不属于现有的任一血清型。制备猪链球菌CZ130302菌株的高免血清。该血清与现有的35个血清型菌株进行凝集反应试验,结果均为阴性。150只BALB/c小鼠随机分为15组,测定CZ130302的半数致死量(LD5o)为2.89×106 CFU/只。对照猪链球菌2型毒力株P1/7的致死率为1/10,HA9801的致死率为2/10。攻毒试验接种2×107CFU/只,结果显示CZ130302的致死率为8/10,感染小鼠出现共济失调,转圈以及抽搐,小鼠剖检症状与病猪的症状吻合,剖检取病鼠的脑组织制作组织切片,发现脑部细胞出现典型的细菌性脑膜炎的病理特征,表现为大量中性粒细胞的浸润,胶质细胞噬神经原现象以及大量神经细胞的固缩和液化。人喉癌上皮(HEp-2)细胞粘附试验发现CZ130302的定植力与强毒株HA9801定植力相当,低于欧洲经典毒力株(1×107 CFU/well):小鼠脑内皮(bEnd.3)细胞的粘附试验中,CZ130302菌株则与HA9801和P1/7相一致(p<0.01)。对CZ130302的毒力因子检测结果表明该新型菌株的毒力基因型为gdh+/lorf2+/purD+/gene+/DltA+/PgdA+ /Sortase A+/SspA+,不同于HA9801的毒力表型特征mrp+/epf+/sly+。2.CZ130302株荚膜合成相关基因分析及PCR定型方法的建立CZ130302菌株全基因组测序并补洞和拼接,结果证实该菌株在进化树中处于独立的分支中,既不属于29个猪链球菌血清型分支,也不属于建议被排除在猪链球菌以外的32、34以及20、22、26、33血清型。通过荚膜合成相关基因序列的比对和分析发现,CZ130302株完整的荚膜基因组与现公布的猪链球菌不同血清型的荚膜基因组结构相似,荚膜合成途径依赖于Wzy/wzx的转运途径。CZ130302菌株的荚膜基因组的开放阅读框(orf)和蛋白质同源组(HGs)的注释和命名暂定为“Chz”的的注释和命名,Chz-A至Chz-G的序列同源性较高,都在90%以上,在其他血清型的CPS比对中也较为统一；Chz-G至Chz-J区间差异性较大,一般都在50%左右；Chz-J至Chz-P具有典型的型特异性。共发现23个HGs和4个未知的HGs,包括多糖合成酶(Wzy Polysaccharide polymerase)基因、翻转酶(Wzx flippase)基因、糖基转移酶(glycosyl transferase)基因以及乙酰基转移酶(acetyltransferase)基因等荚膜代谢途径看家基因。与现有的猪链球菌血清型进化树分析发现,CZ130302菌株的以上4个看家基因处在独立的分支中,与猪链球菌的其他血清型的进化关系相似。选择Wzy/wzx的看家基因,作为PCR定型的基因设计Chz-M和Chz-O扩增引物,在已经建立的多重PCR分型体系中与参考血清型的菌株反应,发现Chz-M基因引物与其他参考株无交叉反应。凝集试验和Chz-M定型引物检测实验室保存的64株未能定型临床分离株,筛选出三株该血清型的临床分离株,分别为AH681(安徽,2006),HN136(河南,2007),CZ1109(江苏,2011),血清凝集试验结果发现AH681株反应结果为阴性,其余两株为阳性反应结果。电镜检测AH681菌株无荚膜结构。测定CZ130302、AH681、HN136新型细菌的半数致死量(LD50),结果显示CZ1109的LD5o为2.433×106CFU/只,接近于CZ130302的半数致死量。而AH681和HN136无法检测出LD5o。对猪链球菌的7个看家基因(dpr、mutS、cpn60、thrA、recA、aroA、gki)PCR扩增后测序,建立多位点序列分型(MLST)图谱,结果显示CZ130302以及CZ110902属于ST-383型,不属于临床分离的败血症致病株ST-1型。无荚膜的菌株AH681属于ST-475型,也不属于其他的ST型；HN136属于ST-264型。综上,从罹患脑膜炎的仔猪脑组织中分离得到猪链球菌CZ130302,感染BALB/c小鼠后复制出相同的脑膜炎症状,为一株新血清型的猪链球菌。该菌株的荚膜多糖基因的合成依赖于Wzy/wzx的转运途径。应用建立的两种血清型的定型方法从未定型的猪链球菌中检测出三株猪链球菌同属于新血清型。四株细菌中包含强毒株以及无毒株,有荚膜株和无荚膜株。